Avaliação da especificidade e da capacidade produtiva da enzima friedelina sintase a partir de estudos de mutação sítio-dirigida

Abstract

Plantas constituem uma das principais fontes de produtos naturais bioativos, sendo capazes de sintetizar substâncias complexas e estereoespecíficas utilizadas para o tratamento de diversas doenças. Dentre essas substâncias, a friedelina se destaca pelo potencial gastroprotetor, antimicrobiano, hipolipemiante e por possuir uma carbonila na posição C-3 que faz com que a mesma seja precursora de substâncias com propriedades citotóxicas como a pristimerina, o celastrol e a maitenina, marcadores taxonômicos da família Celastraceae. Ademais o alto potencial terapêutico, a quantidade produzida desses metabólitos pelas plantas é pequena, de modo que alternativas de engenharia metabólica, com a expressão dos genes de plantas em sistemas heterólogos aliada à engenharia de proteínas para otimizar e aumentar a atividade das enzimas, vêm se mostrando promissoras. Desse modo, esse estudo avaliou a expressão da enzima friedelina sintase de Monteverdia ilicifolia (Celastraceae) e Populus davidiana (Salicaceae) em Saccharomyces cerevisiae. Resíduos específicos de ambas as enzimas foram modificados geneticamente por meio de reações de mutação sítio-dirigida, sendo as posições selecionadas a partir do uso do alinhamento múltiplo de sequências (MAS) e a análise da interação entre o sítio catalítico da enzima modelada e o produto friedelina. Após a obtenção dos genes mutantes, a sequência codificadora das enzimas foi clonada em um vetor de expressão, sendo o DNA recombinante transformado em levedura. Posteriormente, essa linhagem foi cultivada em meio seletivo e os terpenos extraídos e avaliados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). O teor de friedelina produzido pelas leveduras foi quantificado através de uma curva analítica utilizando colesterol como padrão interno. O teor de friedelina obtido para as enzimas selvagens de M. ilicifolia e P. davidiana foram de 2,024 ±0,169 mg/L e 1,024 ±0,072 mg/L, respectivamente. Dentre os mutantes avaliados, G533A apresentou um aumento na produção de friedelina de 1,8-3,6x (3,633 ±0,203 mg/L), enquanto as alterações na posição 729 resultaram em perda da função. As demais mutações apresentaram resultados mistos de acordo com a natureza da enzima mutada. Os resultados aqui apresentados são importantes para melhorar o entendimento sobre a estabilidade e capacidade produtiva dessas enzimas que produzem a friedelina, o único triterpeno carbonilado da cascata de rearranjos da via biossintética.

Plants are one of the main sources of bioactive natural products, being capable of synthesizing complex and stereospecific substances used for the treatment of diseases. Among these substances, friedelin is a triterpene with a lot of biological activities described, including gastroprotective, antimicrobial and hypolipidemic potential. This compound is known for having a carbonyl group at C-3 position, which makes it a precursor of cytotoxic quinonemethide triterpenes such as pristimerin, celastrol and maytenin, chemical markers of the Celastraceae family. Despite this potential, the amount of friedelin produced by host plants are low. In that case, the use of metabolic engineering alternatives with the expression of plant genes in heterologous systems combined with protein engineering can be a promising way to increase the production of this compound, while site-directed mutagenesis studies can determine the influence of key residues in the activity and specificity of the enzyme friedelin syntase. This study evaluated the expression of the enzyme friedelin synthase from Monteverdia ilicifolia (MiFRS) and Populus davidiana (PdFRS) in Saccharomyces cerevisiae. Specific residues of both enzymes were genetically modified through site-directed mutagenesis reactions, with key-positions for mutagenesis being selected using multiple sequence alignment (MAS) and molecular modelling. After these PCR reactions, the coding sequences were cloned into an expression vector and the recombinant DNA was transformed into yeast. Sebsequently, the strains were cultivated in a selective medium and the terpenes were extracted and evaluated by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The mutations that produce friedelin were quantified through a calibration curve using cholesterol as standard. The friedelin content obtained for the wild-type enzymes were 2.024 ±0.169 mg/L for MiFRS and 1.024 ±0.072 mg/L for PdFRS. Among the mutants, G533A achieved a production of 3.633 ±0,203 mg/L, an increase from 1.8- 3.6 fold in comparison with the wild type enzymes. Mutations at the position 729 led to a loss of the enzyme function, while other residues showed mixed results. The results presented here are important to the understanding of the stability, specificity and productive capacity of friedelin synthase, the enzyme that produces the only carbonyl pentacyclic triterpene in the cascade of rearrangements of the biosynthetic pathway.