Melhoramento da termoestabilidade da xilanase do fungo Thermoascus aurantiacus, expressa em E. coli, por evolução dirigida e desenho racional: Produção, purificação, caracterização bioquímica e biofísica da enzima

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dc.contributor.advisorSilva, Roberto da [UNESP]
dc.contributor.advisorMertens, Jeffrey
dc.contributor.advisorTorres, Fernando Araripe Gonçalves
dc.contributor.authorSouza, Angélica Rodrigues de
dc.contributor.institutionUniversidade Estadual Paulista (Unesp)
dc.date.accessioned2018-05-25T19:27:44Z
dc.date.available2018-05-25T19:27:44Z
dc.date.issued2016-03-04
dc.description.abstractA proposta inicial deste trabalho foi o melhoramento da termoestabilidade da xilanase do fungo T. aurantiacus (XynA_Ta), expressada em S. cerevisiae (XynA_Sc), a partir da construção anteriormente obtida em P. pastoris (xynA_Pp). Contudo, a reduzida expressão de XynA_Sc, aliada a duas mutações de aminóacidos, motivaram a reclonagem do gene de xynA_Ta em E. coli (xynA_Ec). O Capítulo 1 descreve o estudo da produção e caracterização de XynA_Sc, XynA_Pp e XynA_Ec, anterior as correções das mutações. Estas exibiram ótimos de expressão com 650, 5,8 e 815 U.mL-1, após 96 h e de atividade em pH 5-5,5 e 65-70 °C. XynA_Ec destacou-se com ampla faixa de estabilidade, de 40 a 85 °C, após 1h, e XynA_Pp mostrou 100% de atividade em pH 6-8, após 24 h. XynA_Sc e XynA_Pp apresentaram forte ativação em solventes orgânicos. A XynA_Sc foi inibida em concentrações superiores a 20 mg.mL-1 de substrato. O Capítulo 2 apresenta resultados da obtenção da forma nativa (corrigida) (XynAc_Ec) e de onze mutantes por MSD. Todas linhagens foram expressas, purificadas e fatores bioquímicos auxiliaram na seleção dos três mais termoresistentes. Estes foram caracterizados, juntamente com XynAc_Ec, frente a fatores biofísicos (CD) e estruturais (por homologia - 1TUXPDB). Destaque para o mutante H209N com maior termoestabilidade, atividade catalítica e Tm de 71,3 °C. O aumento na estabilidade térmica foi relacionado ao incremento de hélices curtas, pontes salinas e a carga positiva no core catalítico (trabalho publicado). O Capítulo 3 apresenta resultados da combinação in sílico dos três mutantes termoestáveis, com base em dados estruturais (homologia - 1TUX-PDB). Q158R / H209N / N257D exibiu maior conteúdo de interações salinas e menor RMSF. Portanto, XynA_Pp, XynA_Ec e H209N são enzimas potenciais para aplicação em bioprocessos; e estudos in sílico sugerem que mutante Q158R / H209N / N257D seja obtido in situ.pt
dc.description.abstractThe initial purpose of this work was the improvement of xylanase thermal stability of fungus T. aurantiacus (XynA_Ta), expressed in S. cerevisiae (XynA_Sc) from the building previously obtained in P. pastoris (xynA_Pp). However, the reduced expression of XynA_Sc, combined with two mutations of amino acids, led to the recloning xynA_Ta gene in E. coli (XynA_Ec). Chapter 1 describes the study of the production and characterization of XynA_Sc, XynA_Pp and XynA_Ec, previous mutation corrections. These showed great expression with 650, 5.8 and 815 U.mL-1, after 96 h and activity at pH 5-5.5 and 65-70 °C. XynA_Ec displayed wide stability range from 40 to 85 °C, after 1h, and XynA_Pp showed 100% activity at pH 6-8, after 24 h. XynA_Sc and XynA_Pp exhibited stronger activation in organic solvents. The XynA_Sc was inhibited by concentrations greater than 20 mg.mL-1 of substrate. Chapter 2 describes the native correction (XynAc_Ec) and construction of eleven mutant obtained by the MSD. All strains were expressed, purified and biochemical factors helped in the selection of the three most heat resistant. These were characterized, along with XynAc_Ec, by biophysical (CD) and structural factors (homology - 1TUX-PDB). H209N mutant displayed higher thermal stability, catalytic activity and Tm of 71.3 °C. The increase in thermal stability was related to short helices content, salt bridges, and the positive charge in the catalytic core (published work). Chapter 3 presents results of in silico combination of the three thermostable mutants, based on structural data (homology - 1TUX-PDB). Q158R / H209N / N257D showed higher content of bridges interactions and lower RMSF. Therefore, XynA_Pp, XynA_Ec and H209N are potential enzymes for applied bioprocesses; and studies in silico suggest that mutant Q158R / H209N / N257D should be obtained in situ.en
dc.description.sponsorshipFundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
dc.description.sponsorshipIdFAPESP: 2011/22461-4
dc.identifier.aleph000902231
dc.identifier.capes33004153074P9
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11449/154101
dc.language.isopor
dc.publisherUniversidade Estadual Paulista (Unesp)
dc.rights.accessRightsAcesso aberto
dc.subjectS. cerevisiaept
dc.subjectP. pastorispt
dc.subjectE. colipt
dc.subjectEndo-xilanasept
dc.subjectTermoestabilidadept
dc.subjectMutantespt
dc.subjectEndo-xylanaseen
dc.subjectThermalstabilityen
dc.subjectMutantsen
dc.titleMelhoramento da termoestabilidade da xilanase do fungo Thermoascus aurantiacus, expressa em E. coli, por evolução dirigida e desenho racional: Produção, purificação, caracterização bioquímica e biofísica da enzimapt
dc.title.alternativeImproved thermal stability of Thermoascus aurantiacus GH10 xylanase, expressed in E. coli, by directed evolution and rational design: Production, purification, biochemical and physico-chemical characterization of the enzyme.en
dc.typeTese de doutorado
unesp.campusUniversidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, São José do Rio Pretopt
unesp.embargo24 meses após a data da defesapt
unesp.graduateProgramMicrobiologia - IBILCEpt
unesp.knowledgeAreaMicrobiologia aplicadapt
unesp.researchAreaMicrobiologia industrial, ambiental e de alimentospt

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