Teses - Microbiologia - IBILCE

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https://hdl.handle.net/11449/77132

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Estudo de antagonismo fúngico de extratos de culturas de Candida spp. e Trichophyton spp. contra agentes de onicomicoses
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-06-22) Lemes, Thiago Henrique; Margarete Teresa Gottardo de, Almeida; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Onicomicoses são infecções de unhas causadas principalmente por fungos dermatófitos, seguidos de leveduras e fungos filamentosos não dermatófitos (FFNDs). Caracterizam-se por condições clínicas persistentes, de terapêutica prolongada com altas taxas de recorrência, sendo as infecções mistas, responsáveis por quadros de recorrência e recalcitrância. Adicionalmente, o escasso arsenal antifúngico utilizado para o tratamento e a mudança no perfil de suscetibilidade dos agentes etiológicos tem contribuído para o difícil controle das onicomicoses. O presente estudo avaliou a atividade antifúngica dos extratos obtidos de culturas puras e mistas entre dermatófitos e Candida parapsilosis contra linhagens de Trichophyton rubrum e T. mentagrophytes. Foram realizados ensaios de toxicidade, in vivo, com Galleria mellonella, do efeito combinatório dos extratos com fármacos itraconazol, fluconazol e terbinafina, da cinética de morte com ensaio Time kill, investigação de ação dos extratos sobre parede ou membrana além da determinação do perfil químico dos extratos através da técnica de FTIR (infravermelho transformada de Fourier). O antagonismo foi determinado através dos ensaios de microdiluição com resultados de valores de concentração inibitória mínima (CIM) entre 250 e 8000 µg/mL contra as cepas de dermatófitos e leveduras. Na cinética de morte microbiana, as atividades dos extratos resultaram em dados de completa inibição de dermatófitos em 48 horas, comparando-se aos controles. O efeito combinatório dos extratos de cultura com os antifúngicos demonstrou sinergismo, com decréscimo nos valores de CIM: fluconazol de 2 para 0.25 µg/mL; itraconazol de 0.25 para 0.03 µg/mL; terbinafina de 0.01 para 0.002 µg/mL; e extratos de 4000 para 1.9 µg/mL. A estrutura alvo de ação dos extratos foi a membrana citoplasmática fúngica. Os ensaios de toxicidade dos extratos com Galleria mellonella foram negativos. Pode-se inferir que os extratos de cultura obtidos a partir de linhagens clínicas de Candida parapsilosis e dermatófitos, apresentam notáveis metabólitos bioativos atóxicos, capazes de inibir fungos patogênicos, abrindo novas perspectivas terapêuticas.
Avaliação de peptídeos sintéticos na inibição do vírus Chikungunya
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-05-04) Ayusso, Gabriela Miranda; Rahal, Paula [UNESP]; Calmon, Marilia de Freitas [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O vírus Chikungunya (CHIKV) apresenta distribuição mundial e é considerado um grave problema de saúde pública. A natureza debilitante e crônica associada à infecção por CHIKV e a ausência de uma terapia antiviral aprovada demonstram a necessidade de fármacos específicos que atuem no ciclo replicativo do vírus. A descoberta do potencial terapêutico de diversos peptídeos despertou o interesse da comunidade científica nessa classe de substâncias que apresenta ampla atividade biológica, destacando a antiviral. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial antiviral do peptídeo sintético (p-BthTX-I)2K e do protótipo peptídico sintético AG-Hecate e seus análogos PSSct1905 e PSSct1910 contra a infecção por CHIKV. A citotoxicidade dos peptídeos foi determinada em células de fibroblastos renais de hamster recém-nascido (BHK-21) e/ou células epiteliais de hepatocarcinoma humano (Huh-7) pelo ensaio de MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]. O efeito antiviral foi investigado por meio da mensuração da atividade da proteína NanoLuciferase, codificada pelo CHIKV-NLuc. Todos os peptídeos exibiram atividade inibitória sobre o ciclo de replicação do CHIKV. O AG-Hecate e seu análogo PSSct1905 foram os mais ativos, apresentando ação antiviral maior que 91%. O peptídeo AG-Hecate e seus análogos atuaram em diferentes etapas do ciclo replicativo do CHIKV em células BHK-21 e Huh-7. O análogo PSSct1905 demonstrou efeito protetivo nas células contra a infecção viral. A entrada do CHIKV em ambas as linhagens celulares também foi afetada pelos peptídeos PSSct1905 e PSSct1910, desencadeando inibição da adsorção e internalização viral. Por fim, o protótipo AG-Hecate e seus dois análogos apresentaram atividade antiviral nas etapas de pós-entrada do ciclo de replicação viral nas duas células avaliadas. O peptídeo (p-BthTX-I)2K, por sua vez, exibiu ação anti-CHIKV ao interferir nas etapas iniciais do ciclo de infecção viral. O mesmo impediu a entrada do CHIKV em células BHK-21 por meio da inibição das etapas de adsorção e internalização viral. Além disso, observou-se que o efeito inibitório do peptídeo (p-BthTX-I)2K na entrada viral foi mais significativa na adsorção do que na internalização do CHIKV em células BHK-21. Portanto, esse estudo destacou o peptídeo (p-BthTX-I)2K e o protótipo peptídico AG-Hecate e seus análogos PSSct1905 e PSSct1910 como promissores candidatos a fármaco contra a infecção por CHIKV. Ademais, considerando as propriedades antivirais desses peptídeos, sugere-se a utilização das estruturas dos mesmos como base para o planejamento de novos antivirais de amplo espectro.
Produção, purificação e caracterização bioquímica funcional de uma α-L-arabinofuranosidase secretada pelo fungo Coriolopsis byrsina
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-04-14) Nascimento, Carlos Eduardo de Oliveira; Silva, Ronivaldo Rodrigues da [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As α-L-arabinofuranosidases podem ser produzidas por fungos, bactérias e plantas e são responsáveis pela clivagem de ligações glicosídicas α-1,2, α-1,3 e α-1,5 envolvendo arabinose. Nos últimos anos, muitos estudos têm demonstrado suas aplicações no processamento de sucos, visando diminuir a viscosidade e promoção da clarificação, e hidrólise de biomassa vegetal. Outro interesse por estas enzimas decorre de sua capacidade para melhorar a liberação de compostos aromatizantes presentes em bebidas como vinho, cerveja e sucos. Em vista das diferentes aplicações, o presente trabalho focou na prospecção de α-L-arabinofuranosidases dos fungos filamentosos Thermothelomyces heterothallica, Rasamsonia emersoni e Coriolopsis byrsina SXS16. Em seguida, conforme a capacidade de produção de α-L-arabinofuranosidases, foi purificada uma enzima secretada pelo fungo C. byrsina SXS16 e investigada suas propriedades bioquímicas funcionais. A enzima purificada, com massa molecular estimada em 55 kDa, exibiu máxima atividade a pH 3,5-4,0 e 50 ºC, e estabilidade em faixa de pH 3-8 a 4 °C por 24 horas, e temperatura de 10 a 60 ºC por 1 hora, cujas atividades remanescentes foram superiores a 70%. A enzima também se mostrou estável a etanol 5-10% após 24 horas de incubação a 28 °C, retendo atividade enzimática superior a 75% após incubação com etanol 5%, e para etanol 10%, superior a 60% de atividade. Ao avaliar a atividade enzimática sob a influência de íons metálicos, foi observado uma redução da catálise para para todos os íons, especialmente Fe3+ e Hg2+, cujas atividades enzimáticas residuais foram 25% e 33%, respectivamente. Em presença de D e L arabinose, a inibição enzimática foi notada apenas com L-arabinose, exibindo 50% de atividade residual a 0,2 mol L-1 e 30% a 0,9 mol L-1 deste açúcar. A enzima foi ativa sobre p-Nitrofenil-α-L-arabinofuranosideo (pNPA) e p-Nitrofenil-β-D-xilopiranosideo (pNPX), com 6,71 ± 0,23 e 0,38 ± 0,07 U mg-1, respectivamente, e para cinética enzimática com o substrato pNPA, notamos um KM de 3,45 ± 0,9 mmol L-1 e Vmax de 198,2 ± 24 μmol min-1 mg-1. A enzima também foi capaz de hidrolisar α-1,5-L-arabinana linear, mas nenhuma atividade foi notada sobre os substratos p-Nitrofenil-β-D-glucopiranosídeo e p-Nitrofenil-N-acetil-β-D-glicosaminídeo.
Produção de ácido ferúlico usando descarboxilase heteróloga de Klebsiella pneumoniae TD 4.7 e aplicação da enzima na produção de 4-vinilguaiacol
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-24) Santos, Maitê Bernardo Correia dos; Gomes, Eleni [UNESP]; Alonso, Sergio Gómez; Ruller, Roberto [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Derivados vinílicos comercialmente importantes podem ser obtidos em bioprocessos por descarboxilação de ácidos fenólicos, como o ácido ferúlico e o ácido p-cumárico, por enzima como a ácido ferúlico descarboxilase, resultando em compostos de valor agregado como 4-vinilguaiacol e 4-vinilfenol, respectivamente. Neste estudo, o gene que codifica a ácido ferúlico descarboxilase em Klebsiella pneumoniae TD 4.7 foi isolado e identificado como um fragmento de 504 pb, que codifica um polipeptídeo de 167 resíduos de aminoácidos. O gene foi expresso em Escherichia coli BL21(DE3), e a enzima recombinante, purificada como uma proteína de 22 kDa, com maior atividade em pH 5,5 e a 40°C. A ácido ferúlico descarboxilase recombinante foi completamente inibida por Hg+2, Zn+2, Cu+2 e Cd+2 e apresentou aumento de atividade na presença de Co+2 (aproximadamente +20%). Os valores de Km e Vmax foram estimados para o substrato ácido ferúlico em 2,95 mM e 102,10 µmol.min-1.mg-1. A enzima ácido ferúlico descarboxilase teve seu modelo predito gerado usando os programas de predição estrutural AlphaFold Multimer e Swissmodel, com um RMSD de apenas 0,7 Å, demonstrando a ausência de cisteína e pontes dissulfeto no homodímero, a presença de grandes quantidades de lisina, e os resíduos envolvidos no ciclo catalítico Tyr27, Glu134 e Asn23. A enzima foi testada para conversão dos ácidos ferúlico e p-cumarico obtidos por hidrólise de bagaço de cana de açúcar em método de extração sólido-líquido alcalina convencional. Nessa hidrólise, obteve-se 135,41 mg L-1 de ácido ferúlico e 948,82 mg L-1 de ácido p-cumárico, dos quais foram obtidos 53,58 mg L-1 de 4-vinilguaiacol e 437,89 mg L-1 4-vinilfenol, rendimentos de 43% e 55% respectivamente. Estes resultados indicaram a viabilidade do uso destes compostos obtidos de fonte renovável, para a produção de flavours naturais de valor comercial.
Avaliação da atividade antiviral de peptídeos sintéticos contra o Zika vírus
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-02-24) Lima, Maria Letícia Duarte; Rahal, Paula [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O Zika vírus (ZIKV) é um arbovírus pertencente à família Flaviviridae, genêro Flavivirus. Teve seu primeiro caso de transmissão autóctone relatado no Brasil em 2015 e, nesse mesmo período, espalhou-se para outros países e casou um grande surto nas Américas. A infecção por ZIKV é, em sua maioria, assintomática ou possui sintomas leves, porém esse vírus é capaz de causar complicações que envolvem alterações neurológicas, causando um impacto significativo na saúde pública. Uma delas é a Síndrome Congênita do Zika em bebês de mulheres infectadas durante à gestação. Além disso, esse vírus pode causar a Síndrome de Guillain-Barré em adultos. Atualmente, não há vacinas ou medicamentos específicos para o ZIKV, fazendo-se necessário a busca pelos mesmos. Na procura por novas terapêuticas, peptídeos tem se mostrado moléculas com grande potencial para essa finalidade, inclusive na busca por antivirais, já que tem sido observado que fazem inibição seletiva e apresentado relativas tolerabilidade e segurança. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial antiviral dos peptídeos sintéticos AG-peptídeo (GA-KKALKKLKKALKKAL-CONH2) e (pBthTX-I)2K [(KKYRYHLKPFCKK)2] em células Vero infectadas pelo ZIKV. Para isso, primeiramente foi avaliada a citotoxicidade dos peptídeos nessas células por meio do ensaio de MTT, tendo sido determinada a máxima concentração não-tóxica de 25µM para ambos os peptídeos, e foi esta a concentração utilizada para os ensaios antivirais. Foi então realizado um ensaio de triagem a fim de avaliar se os peptídeos possuíam efeito antiviral contra o ZIKV. O AG-peptídeo demonstrou inibição de 88,57% dos níveis de RNA viral e para o (pBthTX-I)2K foi de 67,28%. Confirmada a atividade antiviral, foram realizados ensaios para compreender em que etapas do ciclo replicativo os peptídeos estão agindo. Ambos os peptídeos mostraram proteger as células Vero contra a infecção por ZIKV. O AG-peptídeo apresentou efeito virucida e também atuou inibindo a entrada de ZIKV nas células, especificamente as etapas de adsorção e internalização. Finalmente, tanto o AG-peptídeo quanto o (pBthTX-I)2K foram capazes de inibir o ZIKV em etapas pós-entrada nas células Vero. Em conclusão, ambos os peptídeos se mostraram potenciais antivirais contra o ZIKV in vitro, sendo que o AG-peptídeo teve ação em todas as etapas do ciclo replicativo viral analisadas no presente trabalho, enquanto o (pBthTX-I)2K foi capaz de proteger as células Vero da infecção por ZIKV e atuar nas etapas após a entrada viral nas células. Apesar de mais ensaios são necessários para determinar o mecanismo de ação desses peptídeos, o presente trabalho demonstrou moléculas com grande potencial para o desenvolvimento de antivirais contra o ZIKV.
Síntese e avaliação de metoxichalconas como agentes antidermatofíticos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-18) Nascentes, Julyanna Andrade Silva [UNESP]; Regasini, Luis Octavio [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As chalconas são substâncias de plantas que apresentam inúmeras bioatividades, dentre elas atividade antifúngica, sendo de síntese concisa. Estudos realizados por este grupo de pesquisa demonstraram a ação da 2´,4´-dimetoxichalcona (JA-0) contra espécies de Candida, exibindo Concentração Inibitória Mínima (CIM) entre 15,6 µg/mL e 61,2 µg/mL. Com o objetivo de otimizar a atividade antifúngica dessas dimetoxichalconas, foi proposta uma série de análogos de JA-0 com modificações no anel B, por meio de substituintes eletrodoadores e eletroatratores. A síntese desses análogos, foi realizada por meio da reação aldólica de Claisen-Schmidt. A avaliação antidermatofítica foi realizada contra Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis e Epidermophyton floccosum incluindo cepas de referência da American Type Culture Collection (ATCC) e isolados oriundos de micoses superficiais. A partir dos valores da CIM, foram selecionados os três compostos mais ativos para avaliação da sua combinação com diferentes fármacos antifúngicos, a avaliação do tempo de morte e a avaliação da toxicidade contra queratinócitos humanos e larvas de Galleria mellonella. Foram obtidos trinta e um compostos com rendimentos globais entre 15 e 96%, e pureza entre 90 e 98%. Cinco substâncias são inéditas na literatura, JA-2F, JA-3Br, JA-3OMe, JA-2OH3F e JA-4-terc. Os ensaios de susceptibilidade fúngica in vitro indicaram os valores de CIM e da Concentração Fungicida Mínima (CFM). Os análogos mais ativos contra os dermatófitos exibiram valores de CIM entre 0,9 µg/mL e 31,2 µg/mL. Os compostos JA-0 e JA-2F apresentaram atividade antidermatofítica mais pronunciada sendo selecionadas para estudos mais aprofundados. O composto JA-4OMe, é um fármaco chalcônico já em comercialização, nos motivando a continuar com sua avaliação contra os dermatófitos. Os compostos JA-0, JA-2F JA-4OMe provocaram danos a membrana plasmática e na parede celular da célula fúngica, o que pode ser sugestivo para um mecanismo de ação. Ao combinar os análogos metoxilados com os antifúngicos anfotericina B, caspofungina, fluconazol, terbinafina e voriconazol, esses evidenciaram efeito sinérgico em combinação com a maior parte dos fármacos testados. Quanto a toxicidade contra G. mellonella, os três análogos não apresentaram toxicidade a 500 µg/mL. Os resultados obtidos indicam uma potencialidade das metoxichalconas para o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos, demonstrando potencial aplicabilidade para o tratamento de dermatofitoses.
Água ozonizada – Estudo de atividade antimicrobiana contra patógenos hospitalares
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-19) Caetano, Maicon Henrique; Almeida, Margarete Teresa Gottardo de; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) representam um grave problema de saúde pública, por aumentar as taxas de morbidade, mortalidade e os custos. Microrganismos potencialmente patogênicos, principalmente os multirresistentes aos antimicrobianos podem estar presentes em superfícies hospitalares, aumentando ainda mais os riscos de infecções. É imprescindível a busca por novos processos de desinfecção em serviços de saúde. A água ozonizada pode elevar os padrões de qualidade das superfícies por meio da redução da carga microbiana, atuando sobre os microrganismos através da oxidação de componentes estruturais da célula, especialmente das membranas celulares, provocando a sua destruição e decorrente morte celular. Sendo assim, o presente estudo tem como objetivo avaliar a eficácia da atividade antimicrobiana da água ozonizada sobre microrganismos e na desinfecção de superfícies hospitalares. Para isto, foi utilizada uma torneira comercial como fonte de água ozonizada (0,6 ppm de ozônio). Frascos reagentes estéreis receberam 200 ml de água e 200 µl dos inóculos de microrganismos em concentração ajustada em espectrofotômetro, na escala 0,5 de McFarland. Posteriormente, 100 µl das amostras foram retirados, após 10 s, 30 s, 1 min e 2 min de contato com a água e plaqueadas em meio de cultura contendo Brain Heart Infusion Agar DIFCO® (BHI) para as bactérias e Sabouraud Dextrose Agar OXOID® (AS) para as leveduras e fungos filamentosos. As placas foram incubadas a 36,5ºC com consequente avaliação quantitativa quanto ao número de unidades formadoras de colônias (UFCs). Para avaliar a eficácia da água ozonizada em um cenário real, cinco superfícies de 19 leitos de UTI, de um hospital terciário do interior do estado de São Paulo (mesa próxima ao leito, puxador da gaveta, monitor, bomba de infusão e lateral da cama) foram avaliadas quanto à presença de microrganismos. Imprints foram estabelecidos com placas RODACTM (com inibidor do quaternário de amônio), em cada superfície, por meio de pressionamento, por 10 s, antes e após a limpeza com água ozonizada. Os resultados mostraram a eficácia da atividade antimicrobiana da água ozonizada contra bactérias e fungos, sendo eliminados a partir do tempo de 10 s. Para todas as superfícies analisadas houve redução significativa da carga microbiana, com percentuais de 78,8% a 98,7%, após a limpeza com a água ozonizada, quando comparadas com as placas controles. Este procedimento rápido, de fácil condução, poderá fazer parte dos protocolos de limpeza e desinfecção hospitalar, uma vez que, microrganismos são eliminados rapidamente, principalmente das superfícies hospitalares.
Avaliação de parâmetros cinéticos, termodinâmicos e caracterização estrutural in silico de uma endoxilanase heteróloga do fungo termofílico Myceliophthora heterothallica F.2.1.4 expressa em Pichia pastoris.
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-06-03) Zanoni, Jéssica de Araújo [UNESP]; Rodriguez, Gustavo Orlando Bonilla [UNESP]; Gomes, Eleni [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Este trabalho realizou estudos sobre propriedades bioquímicas, estruturais e aplicação de uma endoxilanase pertencente à família GH 11 do fungo termofílico Myceliophthora heterothallica F.2.1.4. Foram avaliadas características estruturais através de análises de bioinformática, identificando uma estrutura composta por 65% de folhas beta, apenas 7% de uma alfa hélice e os outros 27% da estrutura total correspondem a enovelamento aleatório (random coil). Os resíduos catalíticos da enzima foram identificados como glutamatos nas posições 89 e 181. A produção da enzima foi feita por expressão heteróloga em Pichia pastoris linhagem X33 (Komagataella phaffi) durante 144 horas a 28 ºC induzida por metanol. A presença da glicosilação na região N-terminal inibiu a afinidade por íons metálicos imobilizadas da cauda de histidina, por isso o protocolo alternativo de purificação foi estabelecido onde obtivemos um rendimento final de 6,0% da purificação. A enzima purificada foi analisada quanto à influência do glicerol sobre parâmetros termodinâmicos e cinéticos, onde o glicerol amentou significativamente Vmax não apresentando variações significativas sobre Km, diminuiu a energia de ativação da reação e da desnaturação térmica, aumentou os valores de meia vida, entropia e entalpia, porém não promoveu alterações nos valores de energia livre de Gibbs da desnaturação térmica. Simulações de dinâmica molecular evidenciaram que a presença do glicerol promoveu menores valores de RMSD e Rg. Os parâmetros cinéticos também foram avaliados na presença de compostos fenólicos, onde apenas os valores de Vmax foram aumentados na presença de ácido siríngico, ácido ferúlico e ácido vanílico. Análises de docking molecular não identificaram sítios de ligação na superfície da estrutura enzimática. Os efeitos observados podem ser atribuídos à adsorção dos fenólicos sobre as fibras de xilana, favorecida pelo pH do meio reacional. A aplicação de 10 U.g-1 da enzima na maceração enzimática para extração do mosto de uva, proporcionou aumento de 8% no rendimento após 2 horas em 55ºC, diminuição da acidez total e aumento nos valores de pH, sólidos solúveis, açúcares redutores e conteúdo de polifenólicos totais. A qualificação dos produtos de hidrólise da endoxilanase foi feita sobre os substratos xilana beechwood e hemicelulose extraída do bagaço de cana-de-açúcar. Em 24 horas de hidrólise foi possível identificar X1, X2 e X5 como produtos principais para a xilana beechwood, a presença de X5 foi relacionada ao mecanismo de transglicosilação descrito na literatura. No mesmo tempo para a hemicelulose extraída do bagaço de cana-de-açúcar foram identificados X1, X2 e X4. A diferença entre os produtos encontrados deve-se à constituição estrutural dos substratos avaliados.
Nanomateriais híbridos contendo prata e óxido de grafeno reduzido para atividade antifúngica
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-03-31) Almeida, Bianca Gottardo; Volanti, Diogo Paschoalini [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Superficial infections of hair, skin or nails, mainly caused by fungi, are often reported by patients in dermatology clinics. In addition to the esthetic impact, itching, pain, nail and tissue deformity, can be a source of entry for other opportunistic or primary pathogens, covering more itchy tissues. The high cost of treatment, toxicity and emergence of resistant pathogens justify the search for new drugs. The aim of this study was to evaluate the antimicrobial activity of reduced graphene oxide (rGO/Ag) and silver nanocomposites (NCs) against microrganisms clinically isolated belonging to the Microbiology Laboratory of the Faculty of Medicine of São José do Rio Preto - FAMERP. The NCs were characterized by X-ray diffraction analysis, and the morphology and characterization of the nanocomposite were investigated by transmission electron microscopy. The antifungal susceptibility assay was performed by the microdilution method based on the CLSI protocol, with modifications. The toxicological profile was tested in vivo model. The hybrid nanoparticles showed great inhibitory effect against all clinical tested strains, without toxicity. In summary this study provides a new alternative therapeutic strategy for the control of dermatomycoses.
Avaliação microbiológica, anti-inflamatória e da capacidade de indução de mineralização de flavonoides como agentes para aplicação em odontologia
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-10-01) Duque, Cristiane; Regasini, Luis Octavio [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Terapias biológicas atuais visam recuperar as funções fisiológicas do complexo dentinopulpar, preservar os tecidos pulpares/periapicais remanescentes e permitir a formação radicular completa em dentes permanentes jovens com infecções endodônticas. Neste contexto, os flavonoides poderiam ser moléculas interessantes a serem empregadas no tratamento endodôntico devido à sua amplitude terapêutica. Este estudo teve três objetivos principais: (1) avaliar a citotoxicidade e os efeitos antimicrobiano/antibiofilme de flavonoides sobre microrganismos de interesse endodôntico; (2) avaliar a citotoxicidade e o efeito de flavonoides sobre marcadores fenotípicos e genotípicos de dentinogênese em células odontoblastóides e (3) avaliar a citotoxicidade e o efeito de flavonoides sobre a produção de marcadores de estresse oxidativo por macrófagos. A atividade antimicrobiana/antibiofilme dos flavonoides EGCG, taxifolina, miricetina, pinocembrina, crisina, galangina, canferol, quercetina e naringina foram avaliadas pela determinação da concentração inibitória mínima (CIM), concentração bactericida mínima (CBM) e ensaios de biofilme mono-espécies, dual-espécies, multiespécies em microplacas e biofilme em dentina radicular com bactérias de interesse odontológico. Os compostos também foram analisados quanto à sua toxicidade sobre fibroblastos L929, pelo ensaio de MTT. Em cultura de células odontoblastóides MDPC-23, os flavonoides foram avaliados quanto ao efeito citotóxico, sobre a atividade de fosfatase alcalina (ALP), na deposição de matriz mineralizada e expressão gênica de ALP, metaloproteinases -2 e -9 (MMP-2 e MMP-9), proteína da matriz dentinária-1 (DMP-1) e sialofosfoproteína dentinária (DSPP). Os flavonoides também foram triados em cultura de macrófagos RAW.267 quanto a citotoxicidade, por ensaios de resazurina, e submetidos aos ensaios de inibição de óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (ROS), na presença de lipopolissacarídeo (LPS). Os dados foram analisados estatisticamente (p<0,05). EGCG e taxifolina apresentaram os melhores efeitos inibitórios contra as espécies bacterianas testadas, principalmente E. faecalis e não foram citotóxicos dentro das CIM obtidas. Além disso, ambos reduziram estatisticamente os biofilmes monoespécies de E. faecalis, A. israelii, S. mutans, L. casei e F. nucleatum, dual-espécies entre essas espécies e E. faecalis, multiespécies com todas essas espécies e em dentina radicular com E. faecalis. EGCG, taxifolina e canferol estimularam a atividade de fosfatase alcalina e a deposição de matriz mineralizada. Além disso, taxifolina e EGCG aumentaram a expressão de ALP sem diferença estatística entre eles, enquanto a taxifolina aumentou notavelmente a expressão de DMP-1 e DSPP. Na presença de LPS, os flavonoides testados levaram à redução dos níveis de NO e ROS, em macrófagos, destacando-se EGCG, taxifolina, miricetina e canferol. Conclui-se que EGCG e taxifolina apresentam potencial antimicrobiano, antibiofilme, anti-inflamatório e indutor de mineralização. Esses flavonoides poderiam ser agentes promissores para aplicação em Endodontia, visando promover a desinfecção dos canais radiculares, controlar a inflamação e estimular o reparo dentinário.
Otimização da produção de amilases e pectinases por Gongronella butleri usando subprodutos agroindustriais
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-09-02) Braga, Héberly Fernandes; Prado, Heloiza Ferreira Alves do [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Objetivou-se determinar e otimizar a produção de amilases e pectinases, por Gongronella butleri sob cultivo em estado sólido (CES), em subprodutos agroindustriais (SA). Foi realizado teste de verificação lítica a 35ºC, em meio líquido e sólido com amido ou pectina; assim como o crescimento micelial em ágar padrão a 25, 30, 35 e 40ºC. A produção enzimática foi obtida pelo CES a 25, 30 e 35ºC em 72 h, sobre diferentes SA caracterizados físico-quimicamente; e as atividades determinadas pelo método de redução do ácido-3,5-dinitrosalicílico (DNS), além do dextrinizante para as amilases. A temperatura foi fixada a 35ºC, e o perfil enzimático pelo DNS foi monitorado para alguns dos SA ao longo de 120 h, visando identificar os picos de maior atividade, que ocorreram em farelo de trigo (FT) e soja (FS). O acréscimo das atividades enzimáticas nesses SA foi testado por planejamento experimental 23, a 35ºC por 72 h, combinando proporções de FT e FS, e variando o teor inicial de solução mineral e CaCl2 dos cultivos; seguido por planejamento um fator por vez, onde se monitorou o efeito de combinações de FT e FS durante 120 h. As melhores condições experimentais obtidas anteriormente foram usadas como parâmetro para se aplicar um delineamento composto central rotacional (DCCR), visando obter o ponto ótimo de produção enzimática, tendo como fatores umidade inicial do meio; temperatura e tempo de cultivo. O fungo desenvolveu-se em meio líquido e sólido contendo amido ou pectina, formando massa micelial em até 24 h. A expansão micelial apresentou diferença significativa (p ≤ 0,05) inicial nas temperaturas testadas, após 72 h, não sendo observado crescimento a 40ºC. Dos SA avaliados, 88,9% induziram atividade amilolítica dextrinizante inferior a 2,5 U mL-1 em ao menos uma das temperaturas, sendo a maior atividade (9,6 U mL-1) observada a 35ºC em FT. As atividades amilolíticas pelo DNS foram ≥ 7,0 U g-1, em todas temperaturas testadas, quando se empregou FS e FT, e para este houve aumento de 31% da atividade pectinolítica de 25ºC para 35ºC. O pico de atividade amilolítica pelo DNS foi atingido em 72 h para FT (13,7 U g-1) e 96 h para FS (16,0 U g-1); os outros SA mantiveram perfis de atividade inferiores a 3,8 U g-1. A atividade pectinolítica atingiu pico de 41,7 U g-1 para FT, e 33,0 U g-1 para FS em 48 h e após emprego do planejamento 23 foi observado acréscimo de 82% na atividade amilolítica e 33% na pectinolítica, quando comparado à média individualizada em FT e FS. As maiores atividades amilolíticas (15,97 U g-1) e pectinolíticas (128,92 U g-1), tenderam a ocorrer em 48 h, e na combinação FT:FS (25%:75%), não diferindo de FT:FS (50%:50%), para pectinases, após planejamento um fator por vez. A ótima produção enzimática (amilases = 32,35 U g-1; pectinases = 246,62 U g-1) obtida por DCCR foi atingida em 61,37% umidade inicial, 30ºC e 68 h de cultivo. Os resultados indicam potencial de produção enzimática, em especial pectinases, por G. butleri quando em FT e FS.
Avaliação in vitro da ação de enzimas oriundas das NETs na replicação viral do hRSV
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-03-05) Lopes, Bruno Rafael Pereira; Toledo, Karina Alves de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As infecções do trato respiratório são extremamente comuns sendo, o Vírus Sincicial Respiratório Humano (hRSV) o principal agente etiológico das infecções virais agudas do trato respiratório inferior, resultando mundialmente em mais de 3 milhões de casos muito graves de bronquiolite por ano. A infecção promove o influxo de células imunes populando o tecido predominantemente com neutrófilos. Estimulado pelo epitélio infectado e por proteínas virais, os neutrófilos secretam seu material genético imiscuído com enzimas granulares que formam as armadilhas extracelulares neutrofílicas (NETs). Essas estruturas possuem ampla atividade microbicida, porém apresentam grande potencial citotóxico, sendo comumente associadas a grande parte do dano tecidual, com consequente agravamento do quadro clínico. Pacientes infectados com hRSV apresentam grande quantidade de neutrófilos e elevado nível de enzimas neutrofílicas nas secreções do trato respiratório, entretanto pouco se sabe sobre a capacidade anti-hRSV dessas proteínas. Intuindo contribuir na elucidação do papel das NETs na infecção por hRSV, propôs-se avaliar o efeito de algumas enzimas sobre a replicação do hRSV in vitro. Para tanto, o efeito da replicação do hRSV, isoladamente ou na presença de diversas concentrações de enzimas das NETs (Mieloperoxidase, Proteínase 3, Catepsina G e Elastase) foi caraterizado e quantificado através de análises morfológicas, ensaios de viabilidade utilizando células HEp-2, perfil eletroforético e ensaios de redução de placas de lise. A presença de Proteinase 3, Catepsina G e Elastase reduziu a morte celular e a formação de placas de lise induzidas pela infecção, bem como a formação de sincícios, uma característica da replicação in vitro. O perfil eletroforético sugere que a proteína F viral, envolvida nos processos de adesão e fusão, interage com estas enzimas gerando pesados complexos ou mesmo clivagem da proteína viral. O conjunto dos resultados, associado ao descrito na literatura, indica que as enzimas das NETs possuem relevante efeito anti-hRSV, provavelmente via interação com as proteínas de superfície do vírion, como a proteína de fusão F.
Diversidade e distribuição de cianobactérias de crostas biológicas do bioma caatinga com base em taxonomia polifásica e análise metagenômica
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-09-30) Lima, Nathali Maria Machado; Branco, Luis Henrique Zanini [UNESP]; Rojas, Miriam Muñoz; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Crostas biológicas (CBs) consistem em uma comunidade de elementos entrelaçados composta por organismos poiquiloídricos, como cianobactérias, algas verdes, microfungos, bactérias, líquens, musgos e microartrópodes. Estas comunidades exercem funções ecológicas importantes e ocorrem nas camadas superficiais do solo, em uma variedade de regiões climáticas ao redor do globo, principalmente em regiões áridas e semiáridas. As cianobactérias são componentes de extrema importância nessas comunidades, sendo consideradas pioneiras e responsáveis por estruturar a camada superior do solo, tornando possível a colonização por outros grupos. Embora as cianobactérias de CBs venham sendo bem estudadas, ainda há muita diversidade não acessada, principalmente na América do Sul. No Brasil, estes estudos estão praticamente restritos às regiões de Cerrado e os dados que foram encontrados até o momento ressaltam a necessidade de ampliação de estudos no país para que também haja o preenchimento de vazio de conhecimento em outros biomas. Dessa forma, a Caatinga, que é um ambiente restritivo, considerada uma das áreas mais quentes entre as regiões semiáridas do mundo e portanto, propício à presença de crostas biológicas, foi escolhida para ser explorada. As coletas foram feitas nos municípios de Cabaceiras, Barra de Santa Rosa e Pocinhos (Paraíba) em quatro localidades, onde amostras das crostas foram recolhidas segundo à metodologia padrão, ao longo de transeções de 200 m. Foram coletadas 10 amostras de crostas em cada local amostrado e também recolhidas porções de solo para a realização de análises de parâmetros físicos e químicos, como nitrogênio total, fósforo total, ortofosfato, matéria orgânica, pH, carbono orgânico e textura do solo. Temperatura, umidade relativa do ar e irradiância foram parâmetros medidos diretamente em campo. Uma parcela de solo de cada amostra foi separada e analisada quanto à presença de cianobactérias, e para cada população registrada foram feitas análises morfológicas e cultivos. Outra parcela de solo de cada amostra foi inoculada em meio de cultura, visando o estabelecimento de culturas de cianobactérias que não tivessem sido observadas anteriormente. As populações cultivadas e consideradas unicianobacteriais tiveram seus materiais genéticos acessados por meio de extração, amplificação e sequenciamento. A última parcela de solo da amostra seguiu para análises metagenômicas, por meio de extração, amplificação e tecnologia de sequenciamento de próxima geração. Foram estudadas 26 populações, sendo nove a partir de amostras provenientes da natureza e outras 17 provenientes de cultivo e analisadas por critérios morfológicos e moleculares. Em todas as quatro localidades estudadas foram encontradas populações de Scytonema e Microcoleus, além de Nostoc também ter sido registrada em três das quatro regiões. Microcoleus e Nostoc foram analisados separadamente, por meio de estudos detalhados de filogenia e resultaram no descrição de seis novos gêneros e 12 novas espécies. A análise de NGS possibilitou uma investigação ecológica, que relacionou a distribuição dos grupos de cianobactérias registradas a fatores ambientais, e também a comparação entre Caatinga e outro bioma propício à formação de crostas, o Pampa. A composição de cianobactérias registrada na Caatinga evidenciou a dominância de organismos adaptados à sobrevivência em ambiente com altas temperaturas e níveis de irradiância. Comumente encontrados em crostas em estágio de desenvolvimento avançado e apresentando uma relação positiva com compostos químicos essenciais para o solo, como fósforo e nitrogênio. Enfatizando assim, a importância das cianobactérias na nutrição dos solos e na consequente criação de condições favoráveis para o estabelecimento de organismos superiores. Como apêndice foram apresentados dados de um estudo realizado em parceria com um laboratório na Austrália. Neste trabalho foram aplicadas técnicas recentes que utilizam cianobactérias provenientes de crostas biológicas na conservação e restauração de espécies de plantas nativas.
Revisão do gênero Sirodotia (Batrachospermales, Rhodophyta)
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-08-28) Rossignolo, Natalia Leocadio; Necchi, Orlando [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Gêneros da ordem das algas vermelhas de águas continentais, Batrachospermales, foram recentemente investigados usando evidências moleculares e morfológicas, mas o gênero Sirodotia ainda não havia sido revisado. O presente estudo teve como objetivos: inferir as relações filogenéticas das espécies dentro do gênero Sirodotia e com outros gêneros da ordem Batrachospermales; conhecer os limites de variação intra e interespecífica com base na análise de três marcadores moleculares: gene plastidial que codifica a subunidade grande da RuBisCO (rbcL), região de “barcode” do gene mitocondrial que codifica a subunidade 1 da citocromo c oxidase (COI-5P) e região de “barcode” do gene nuclear que codifica a subunidade grande do ribossomo (rDNA LSU); e avaliar os caracteres morfológicos de valor diagnóstico para a delimitação de espécies do gênero em âmbito mundial à luz dos novos dados moleculares. Foram analisadas 40 amostras de Sirodotia provenientes de várias regiões do mundo, incluindo África, Ásia, Australásia, América do Norte, América do Sul e Europa, além de espécimes-tipo de seis espécies. Análises filogenéticas concatenadas e de um único gene (rbcL, COI-5P e LSU) mostraram o gênero Sirodotia como grupo monofilético com alto suporte, evidenciando clados ou grupos bem definidos, com nítida repartição biogeográfica delimitando as espécies, além de alta divergência interespecífica (2,1-8,1% e 4,4-10,5%) e baixa variação intraespecífica (0- 2,4% e 0-3,8%) para rbcL e COI-5P, respectivamente. As análises das sequências de LSU revelaram valores de divergência interespecíficas menores (0,7-3,3%) do que as sequências de COI-5P indicando menor poder de resolução como “barcode”. Os caracteres morfológicos diagnósticos previamente utilizados para distinguir o gênero (carpogônio assimétrico com protuberância basal e carposporófito difuso com filamentos prostrados produzindo ramos eretos com carposporângios) foram confirmados neste estudo. Algumas espécies apresentaram padrão biogeográfico bem definido: S. delicatuliformis ocorrência no Brasil e Costa Rica, S. amazonica (regiões centro-oeste e norte do Brasil) e S. cryptica (centro-oeste do Brasil), S. assamica (nordeste da Índia), S. aquiloamericana (sul da América do Norte), S. huillensis (sul e sudeste da África) e S. kennedyi (centro-sul da África). Assim, distribuição geográfica pode ser usada como critério adicional para o reconhecimento dessas espécies. Os seguintes caracteres foram considerados diagnósticos para distinguir as espécies do gênero: número de células dos fascículos primários, arranjo dos espermatângios, parte do carpogônio que produz os filamentos gonimoblásticos e dimensões do carposporângio. Com base na combinação de dados moleculares, morfológicos e biogeográficos foram reconhecidas nove espécies, cinco já descritas (S. assamica, S. delicatula, S. huillensis, S. kennedyi e S. suecica) e quatro novas espécies propostas neste trabalho (S. amazonica, S. aquiloamericana, S. cryptica e S. delicatuliformis). Das espécies previamente consideradas taxonomicamente aceitas no gênero, três (S. cirrhosa, S. gardneri e S. huangshanensis) não puderam ser reavaliadas, pois os espécimes tipo não estavam disponíveis para análise e os caracteres utilizados não foram considerados taxonomicamente informativos; e quatro espécies foram sinonimizadas neste trabalho (S. segawae, S. sinica e S. yutakae com S. suecica; e S. ateleia com S. delicatula).
Estudo de mutações de resistência ao tratamento com drogas de ação direta em pacientes infectados pelo vírus da hepatite C genótipo 3
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-07-01) Campos, Guilherme Rodrigues Fernandes; Rahal, Paula [UNESP]; Oliva, Cintia Bittar [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O tratamento do HCV com antivirais de ação direta (DAAs) resulta em uma resposta virológica sustentada (RVS) que varia de acordo com o genótipo viral. Dentre os genótipos, o genótipo 3 é o segundo mais prevalente no Brasil e o que apresenta a menor RVS. É o responsável por quase 24% dos casos de infecção no país e a literatura possui poucos dados que expliquem essa menor resposta e maior taxa de escape ao tratamento. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi analisar os vírus do genótipo 3 circulantes em pacientes brasileiros, sob tratamento com Daclatasvir (DCV) e/ou Sofosbuvir (SOF), para analisar mutações já descritas associadas à resistência e identificar novas mutações que confiram resistência dentro da NS5A e NS5B, investigando in vitro o comportamento dessas substituições. Dos pacientes inclusos no trabalho, a taxa de recidiva foi de 11,9%, onde a falha no tratamento foi relacionada com diversos fatores, e a presença de mutações associadas à resistência foi um deles. Mutações de resistência descritas na literatura foram observadas para a NS5A nos sítios 30, 62 e 93, onde o último apresentou mutações somente após a administração medicamentosa, indicando uma possível ação da pressão seletiva. Para a NS5B, as substituições foram detectadas nas posições 159, 421 e 554, onde somente a primeira foi mantida após o tratamento. Entre as mutações não conhecidas, S98G se mostrou promissora devido a sua alta frequência em pacientes recidivantes, antes e após o tratamento. As análises in vitro revelaram que S98G apresenta efeito compensatório na replicação viral, sem fenótipo de resistência quando isolada, mas quando presente em conjunto com Y93H, aumentou ainda mais a resistência ao DCV. Utilizando uma nova abordagem in vitro a partir da clonagem do domínio I da NS5A proveniente das amostras clínicas, mutações descritas e não descritas foram selecionadas pela pressão do tratamento com DCV. Os resultados desse estudo abrem possibilidades para compreender um pouco melhor o comportamento viral durante o tratamento, além de entender melhor a dinâmica de seleção de mutações. Dessa forma é possível mapear a frequência de circulação de mutações descritas na literatura e descrever possíveis novas mutações de resistência, delineando assim estratégias terapêuticas mais seguras para evitar o escape do tratamento.
Elucidação estrutural da especificidade por substratos de enzimas da biossíntese de aminoglicosídeos e marginolactonas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-06-26) Cardoso, Tábata Peres; Dias, Marcio Vinícius Bertacine [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Os produtos naturais desempenham um papel importante no desenvolvimento de medicamentos e parte desse sucesso está relacionado com a diversidade química e estrutural apresentadas pelos compostos dotados de relevância biológica. Um exemplo de produtos naturais oriundos do metabolismo secundário de microrganismos são os antibióticos aminoglicosídicos e policetídicos. A complexidade estrutural implica em dificuldades para produzir análogos com atividades medicinais melhoradas. Por outro lado, a biossíntese combinatorial explora a promiscuidade de substratos e emprega enzimas e vias modificadas para produzir novos produtos "não naturais". No presente trabalho, buscamos elucidar estruturalmente enzimas envolvidas na biossíntese de aminoglicosídeos (NeoB, NeoQ, ParB, ParQ, LivB e LivQ) e policetídeos marginolactonas (AMH_821, AMH_828, Medi_4948) com aplicação biotecnológicas. Para isso, genes foram clonados e expressos em Escherichia coli e as proteínas recombinantes foram purificadas. Para as proteínas NeoQ e ParQ, foram realizados teste de expressão a fim de encontrar uma condição de maior rendimento proteico. Para a proteína NeoB, foi realizado um ensaio de deslocamento térmico para escolha do melhor tampão para purificação. Cristais das proteínas NeoB, AMH_828, Medi_4948 foram obtidos em diferentes condições. Aplicamos métodos de resolução estrutural por substituição molecular para todas as proteínas estudadas. Foram resolvidas as estruturas das proteínas NeoB e Medi_4948. A estrutura da enzimaMedi_4948 possui um enovelamento característicos de α/β hidrolases, compartilhado por ureohidrolases e foi possivel observar que ela é hexamêrica, composta por dois trímeros. Esta proteína contém uma alça flexível na região do N-terminal o qual interage com a unidade subjacente do monomero vizinho. O sítio ativo apresenta um cluster binuclear para um íon metal, o qual, juntamente com uma molécula de água é importante para a catálise. A enzima NeoB revelou uma estrutura que contém contém 12 fitas-β e 11 α-hélices. Sete fitas-β formam uma folha-β mista que é bem característico dos membros da superfamília das aspartato aminotransferases. Foi possível também observar um motivo grampo β. Nós mostramos as primeiras informações estruturais obtidas sobre a amidinohidrolase Medi4948 e também conseguimos resultados para outra enzima, uma aminotransferase da biossíntese de neomicina, Neo B.
Avaliação de extratos e substâncias de Pterogyne nitens Tul. (Fabaceae) contra nematoides de interesse veterinário
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-04-03) Lima, Caroline Sprengel; Regasini, Luis Octavio [UNESP]; Chagas, Ana Carolina de Souza [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Um dos maiores problemas sanitários encontrados pela pecuária são os nematoides gastrintestinais (NGIs), os quais causam perdas significativas aos pecuaristas de pequenos ruminantes. O controle de NGIs é realizado com base na administração repetida e imprópria dos anti-helmínticos (AHs) convencionais, havendo uma crescente presença de resíduos no meio ambiente ou em produtos de consumo. Acima de tudo, o desenvolvimento de resistência em populações de NGIs tornou-se um problema mundial. A fim de preservar a saúde dos hospedeiros, bem como retardar a resistência, torna-se necessário identificar métodos alternativos ao uso de AHs, tais como o uso de plantas, seus extratos e substâncias. Pterogyne nitens Tul. (Fabaceae), árvore nativa brasileira, apresenta indicações de uso popular como vermífugo, bem como de diversas substâncias bioativas, tais como: ácidos fenólicos, flavonoides, alcaloides guanidínicos, terpenos e esteróis. O presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos de extratos e substâncias de P. nitens em diferentes estágios do ciclo de vida de três isolados susceptíveis originários do Brasil e da França de duas espécies de NGIs, Haemonchus contortus e Trichostrongylus colubriformis. Foram preparados três extratos etanólicos a partir das folhas (EEL), frutos (EEFR) e flores (EEFL); e oito substâncias fenólicas isoladas [duas flavonas (sorbifolina e pedalitina), dois flavonóis (quercetina e rutina), um flavan-3-ol (ourateacatequina) e três ácidos fenólicos (ácido caféico, ácido ferúlico e ácido gálico)]. E, adicionalmente, dois flavonoides (crisina e morina) foram obtidos comercialmente da Merck®, para auxiliar os estudos de relação entre estrutura química e atividade anti-helmíntica. Os extratos e substâncias foram avaliados contra eclosão de ovos, desenvolvimento larval (L1 para L3) e desembainhamento larval (L3). O EEFL não foi testado nos ensaios, pois sua massa obtida foi suficiente apenas para o isolamento das substâncias. Além de ser uma parte da planta de difícil acesso, em que se dá apenas uma vez e em poucos meses do ano. Ambos extratos etanólicos demonstraram potente atividade anti-helmíntica in vitro contra as duas espécies de NGIs nos três ensaios analisados. No ensaio de eclosão de ovos, o extrato etanólico de folhas (EEL, de 2,9 mg/mL e 316 µg/mL) apresentou atividade anti-helmíntica duas vezes mais potente do que o extrato etanólico de frutos (EEFR, 5,9 mg/mL e 512 µg/mL) contra T. colubriformis e H. contortus, respectivamente. No ensaio de desenvolvimento larval, EEL e EEFR apresentaram valores de EC50 de 8,9 e 20 µg/mL contra T. colubriformis, e EC50 de 47 e 35 µg/mL contra o isolado brasileiro de H. contortus, respectivamente. No caso do ensaio de desembainhamento larval, os valores de EC50 de ambos extratos variaram de 78,6‒158 µg/mL para os três isolados de ambas espécies de NGIs. Esses resultados nos encorajaram a investigar as substâncias que poderiam ser responsáveis pela atividade anti-helmíntica dos extratos etanólicos. Ácidos fenólicos e flavonas foram os mais ativos contra a eclosão de ovos (0,56–4,93 µg/mL) e desenvolvimento larval (18 e 83 µg/mL) do isolado brasileiro de H. contortus, respectivamente. Quercetina foi a substância mais ativa contra eclosão de ovos (0,4 µg/mL) e o desenvolvimento larval (100 µg/mL) de T. colubriformis. Além disso, apresentou eficácia de 1,62 e 5,83 µg/mL contra o desembainhamento larval dos isolados francês e brasileiro de H. contortus, respectivamente. Vale ressaltar que este é o primeiro estudo avaliando a atividade antihelmíntica de P. nitens, bem como algumas substâncias contra H. contortus e T. colubriformis. Contudo, análises in vivo, incluindo estudos de eficácia e segurança, são necessários para melhor entendimento da atividade anti-helmíntica dessas substâncias.
Potencial antitumoral e antimetastático de híbridos moleculares curcumina-cinamaldeído: estudos celulares e moleculares
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-02-20) Anselmo, Daiane Bertholin; Regasini, Luis Octávio [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O câncer é caracterizado por uma proliferação celular descontrolada, desencadeada por diversas mutações genéticas, fatores epigenéticos e ambientais. Apesar dos avanços terapêuticos, esta doença continua a ser responsável por índices de mortalidade elevados em todo o mundo, que é agravado pela grande resistência aos fármacos. Desta forma, se faz necessária a busca por novas substâncias potentes, seletivas e capazes de agir sobre células tumorais resistentes. Os produtos naturais têm despertado interesse científico devido suas inúmeras bioatividades. Dentre estes, a curcumina, isolada dos rizomas de Curcuma longa (popularmente conhecida como açafrão), o cinamaldeído, responsável pelo odor e sabor da canela (Cinnamomum sp.) e as chalconas, flavonoides abundantes em frutas, legumes e plantas, possuem potentes atividades antitumorais contra diversos tipos de câncer. O objetivo deste trabalho foi: a) avaliar a capacidade de inibição da proliferação celular de doze híbridos moleculares de curcumina-cinamaldeído contra células de câncer de mama MCF-7 e MDAMB-231, câncer de colo do útero C33, HeLa, SiHa e CaSki e câncer de vulva A431; b) selecionar o híbrido mais ativo e investigar os possíveis mecanismos celulares e moleculares em linhagens de osteossarcoma U2OS (p53 selvagem) e SAOS (p53 ausente). Pelo ensaio de MTT foi observado que os híbridos foram mais potentes que o cinamaldeído, sendo que híbridos hidroxilados foram mais ativos do que os híbridos metoxilados. O híbrido 5a apresentou maior potência antiproliferativa contra as células avaliadas de câncer feminino exceto para MCF-7, com valores de CI50 variando de 2,7 a 36,5 µM. O híbrido 5a demonstrou maior potência que a curcumina contra as células CaSki, SiHa, C33 e A431, exibiu uma maior seletividade que a curcumina, quando ambas foram testadas contra queratinócitos (HaCaT), além de ter demonstrado mais estável do que curcumina e cinamaldeído sob condições fisiológicas. Ensaios clonogênicos indicaram que 5a foi capaz de inibir a formação de colônias da linhagem A431, após 15 dias de tratamento. O híbrido 5a foi mais ativo contra células de osteossarcoma U2OS (CI50 = 22,4 µM) quando comparado às células SAOS (CI50 = 45,0 µM), sugerindo que a proteína p53 pode ser o seu alvo molecular. O híbrido 5a demonstrou boa atividade na inibição da migração e invasão de células U2OS por meio dos ensaios de wound-healing e transwell, respectivamente. Pela técnica de zimografia, o híbrido 5a indicou que efeitos sobre a migração e invasão pode estar relacionada com a diminuição da atividade da metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2). A análise de Western Blot evidenciou a capacidade de 5a em induzir a expressão das proteínas p53 e DNAJB1 (Heat shock protein 40). Essa indução pode contribuir na atividade de p53, visto que Hsp40 estabiliza a conformação da proteína p53. As análises de citometria de fluxo indicaram que a inibição da viabilidade celular por 5a está relacionada com a indução de morte por apoptose, na qual p53 também pode estar envolvida. O estudo do potencial antitumoral e antimetastático de híbridos moleculares curcumina-cinamaldeídos é inédito na literatura, sendo o primeiro que avaliou a atividade de 5a em níveis celulares e moleculares.
Avaliação do perfil de enzimas hemicelulolíticas de duas espécies de Aureobasidium
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-03-05) Silva, Pedro Lucas Bueno da; Gomes, Eleni [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O grande acumulo de biomassa lignocelulósica oriunda da produção de etanol no Brasil contribui para um aumento em pesquisas para utilização para etanol de segunda geração e produção de enzimas com maior valor agregado. Considerando que o grupo de pesquisa ao qual esse trabalho está vinculado tem desenvolvido pesquisas com celulases, hemicelulases, ligninases, pectinases, esse estudo teve por objetivo selecionar leveduras produtoras dessas enzimas, realizar a caracterização físico-química e a purificação enzimática. Diversos trabalhos tem sido desenvolvidos a fim do reaproveitamento de material lignocelulósico oriundo da produção de etanol por cana-de-açúcar para a produção de enzimas de interesse comercial e sua principal aplicação na produção de etanol de segunda geração. Foi selecionado duas leveduras entre 30 escolhidas da coleção do Laboratório de Bioquímica e Microbiologia Aplicadas UNESP/IBILCE: A. pullulans LB 3.1 e A. leucospermi LB 86 e que foram cultivadas com farelo de trigo. Ambas foram capazes de produzir xilanase, β-xilosidase e β-glicosidase, sendo a maior atividade de xilanase de 72 U ml-1 para LB 3.1 de 5,5 U ml-1 para LB 86, bem como a atividade de β-xilosidase que foi (6,7 U ml-1 ) para LB 3.1 e (4,0 U ml-1 ). Com relação à influência do pH na atividade enzimática foi observado perfis similares para xilanase e βxilosidase produzidas pela levedura A. pullulans LB 3.1, com uma maior atividade na faixa de pH 2,5 a 3,5. Essa característica foi observada também para a β-xilosidase de A. leucospermi LB 86, cuja maior atividade foi observada em pH 3,5. A solução enzimática da cepa LB 3.1 foi submetida a uma purificação parcial e caracterização da β- xilosidase. A enzima possui características ácidas, com melhor atividade em pH 4,5 e demonstrou uma termoestabilidade de até 60 min a 80 ºC, sendo superior a resultados encontrados na literatura.
Avaliação de compostos naturais e sintéticos como antivirais contra o vírus do Chikungunya e Enterovírus A-71
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-02-28) Shimizu, Jacqueline Farinha; Jardim, Ana Carolina Gomes; Harris, Mark; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Nas últimas décadas, diversos vírus que tinham sua ocorrência limitada a pequenas regiões se espalharam pelo globo, causando epidemias e preocupação entre as autoridades de saúde. Apesar dos inúmeros avanços no tratamento das infecções virais, vários destes vírus ainda não possuem tratamento especifico e eficaz. Adicionalmente, a alta taxa de resistência e o surgimento de novas mutações, torna a busca por novos antivirais desafiadora e de extrema importância. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo investigar a atividade antiviral de compostos de origem natural ou sintética contra os vírus da Chikungunya (CHIKV) e Enterovirus A71 (EV-A71). Contra o CHIKV, 48.750 compostos sintéticos foram inicialmente avaliados in silico por docking molecular, dos quais 12 compostos demonstraram apresentar interação com a região de ligação a ADP-ribose do dominío macro da proteína viral não estrutural 3 (nsP3), e foram selecionados para ensaios in vitro. Ensaios de viabilidade celular foram realizados para determinar a máxima concentração não tóxica de cada composto, que foi utilizada nos ensaios anti-CHIKV em células de hepatocarcimona humano Huh-7, transfectadas com os replicons subgenômicos do CHIKV. Os resultados demonstraram que os compostos C5 e C13 na concentração de 20 µM inibiram 53 e 76% da replicação do CHIKV em células Huh-7, respectivamente. Contra o EV-A71, 6 proteínas isoladas da peçonha de serpentes foram testadas em concentrações não tóxicas em células Vero infectadas, sendo avaliadas a atividade virucida, protetiva e contra a replicação do EV-A71. Das toxinas testadas, a crotamina e MJTX-II apresentaram atividade para as três etapas avaliadas, inibindo até 100% da infectividade viral. A MJTX-I e a crotapotina apresentaram atividade virucida e protetiva, enquanto a crotoxina apresentou atividade virucida, e a PLA contra na replicação viral. Os resultados obtidos demonstraram que os compostos sintéticos testados contra o CHIKV apresentaram atividade moderada, porém significante, contra a replicação do vírus. Adicionalmente, as proteínas isoladas da peçonha de serpentes demostraram potente atividade antiviral contra o EV-A71. Mais estudos são necessários para avaliar o potencial dessas moléculas como modelos de antivirais, bem como para um melhor entendimento do mecanismo de ação antiviral.

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