Obtenção de eventos transgênicos de cana-de-açúcar portando os genes bar e vip3Aa e identificação e análise da atividade inseticida de Burkholderia sp. contra Spodoptera frugiperda

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Data

2019-11-18

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Universidade Estadual Paulista (Unesp)

Resumo

O ataque de insetos-praga e a competição com plantas daninhas em cultivos agrícolas estão entre as principais causas de perdas de rendimento. Entre as alternativas disponíveis para a redução destas perdas, são preferíveis as que apresentem menores custos, sejam eficazes e seguras. Adicionalmente, estão ocorrendo sucessivos casos de evolução da resistência em populações de pragas e plantas daninhas, isso torna necessária a avaliação dos meios de controle disponíveis para este fim, além da prospecção de novos métodos e moléculas. Neste sentido, a tese foi dividida em três capítulos, o Capítulo 1 abrange as considerações gerais a respeito do tema e os Capítulos 2 e 3 relatam os experimentos científicos desenvolvidos, que tiveram os seguintes objetivos: Capítulo 2, obtenção e avaliação de plantas transgênicas de cana-de-açúcar, variedade SP80-3280, resistentes a Diatraea saccharalis e ao herbicida glufosinato de amônio, por meio, respectivamente, da inserção dos genes vip3Aa e bar, via Agrobacterium tumefaciens; e, Capítulo 3, prospecção e caracterização de novos isolados bacterianos pertencentes aos gêneros Pseudomonas e Burkholderia com atividade inseticida contra Spodoptera frugiperda e início da caracterização de suas moléculas ativas. No Capítulo 2, obteve-se por meio da transformação genética de cana-de-açúcar 48 eventos PCR positivos, estes foram submetidos a avaliação de resistência à Diatraea saccharalis, principal praga da cultura da cana-de-açúcar no Brasil, que resultou na não detecção de eventos resistentes. Enquanto na avaliação de resistência ao glufosinato de amônio foram obtidos eventos transgênicos que não foram afetados pelas concentrações utilizadas deste herbicida. Ao analisar a expressão gênica do gene bar e vip3Aa por PCR em tempo real, foi observado que o gene vip3Aa sob controle do promotor da ubiquitina 1 apresentou níveis de expressão inferiores aos obtidos pelo gene bar sob o controle do promotor 4xCaMV35S. Isso pode ter ocorrido pela presença do intron adh1 acoplado ao promotor ubiquitina 1. Outra possibilidade sugerida é a atuação de mecanismos de silenciamento gênico, ambas as hipóteses têm potencial para limitar a produção da toxina. Entre os eventos obtidos para o gene bar, os com menores níveis de expressão foram afetados pelo herbicida, enquanto os que apresentaram maiores níveis não se detectou nenhum efeito, demonstrando-se eficientes. No Capítulo 3, entre os isolados avaliados, destacou-se o B2 (Burkholderia sp. isolado 2) com 91% de mortalidade, o qual foi utilizado para as análises posteriores. Obteve-se que a partir de 24 horas de cultivo do isolado em meio líquido houve 100% de mortalidade de S. frugiperda. Na avaliação dos extratos celulares, destacaram-se o meio completo, sobrenadante e meio completo aquecido a 60 ºC por 2 horas, todos resultaram em 100% de mortalidade das lagartas. Desta forma, não há necessidade de adição à dieta de células bacterianas viáveis para que ocorra o efeito, encontrando-se a atividade inseticida predominantemente presente no meio de cultivo. O componente ativo do sobrenadante demonstrou possuir estabilidade frente a enzima pronase E, ao tratamento de 100ºC por 30 min, a autoclave por 20 min e permaneceu no sobrenadante durante a extração proteica com acetona, o que indica não se tratar de uma molécula proteica. Diante dos promissores resultados obtidos com o isolado B2, futuros esforços serão empregados na identificação da molécula ativa, do espectro de insetos-praga controlado, entre outros testes pertinentes, a fim de determinar seu potencial uso como biopesticida.
Pest insect attack and competition with weeds in agricultural crops are among the main causes of yield losses. Among the alternatives available to reduce these losses, those with lower costs, effective and safe, are preferable. In addition, successive cases of resistance evolution are occurring in pest and weed populations, which makes it necessary to evaluate the means of control available for this purpose, as well as the prospection of new methods and molecules. In this sense, the thesis was divided into three chapters, Chapter 1 covers the general considerations on the theme and Chapters 2 and 3 report the scientific experiments developed, which had the following objectives: Chapter 2, obtaining and evaluation of transgenic sugarcane plants, variety SP80-3280, resistant to Diatraea saccharalis and ammonium glufosinate herbicide, by respectively, inserting the vip3Aa and bar genes via Agrobacterium tumefaciens; and, Chapter 3, prospecting and characterization of new bacterial isolates belonging to the genera Pseudomonas and Burkholderia with insecticidal activity against Spodoptera frugiperda and beginning of the characterization of their active molecules. In Chapter 2, 48 positive PCR events were obtained through the genetic transformation of sugarcane. They were submitted to control evaluation of the Diatraea saccharalis, the main pest of sugarcane crop in Brazil, which resulted in no detection of resistant events. While in the evaluation of resistance to ammonium glufosinate were obtained transgenic events that were not affected by the used concentrations of this herbicide. By analyzing the gene expression of bar and vip3Aa gene by real-time PCR, it was observed that the vip3Aa gene under ubiquitin 1 promoter control showed lower levels of expression than bar gene under control of 4xCaMV35S promoter. This may have occurred due to the presence of the ubiquitin 1 promoter coupled intron adh1. Another possibility suggested is the action of gene silencing mechanisms, both hypotheses have the potential to limit toxin production. Among the events obtained for the bar gene, those with the lowest expression levels were affected by the herbicide, while those with the highest levels did not detect any effect, being considered efficient. In Chapter 3, among the isolates evaluated, B2 (Burkholderia sp. isolated 2) stood out with 91% mortality, which was used for further analysis. After 24 h of culture of the isolate in liquid medium, there was 100% mortality of S. frugiperda. In the evaluation of cell extracts, the complete medium, supernatant and complete medium heated at 60 ºC for 2 h, all resulted in 100% mortality of the caterpillars. Thus, there is no need to add viable bacterial cells to the diet for the effect to occur and the insecticidal activity it is predominantly present in the culture medium. The active component of the supernatant was shown to have stability against the pronase E enzyme, treatment of 100 °C for 30 min, autoclave for 20 min and remained active in the supernatant during protein extraction with acetone, indicating that it was not a protein molecule. Front the promising results obtained with the B2 isolate, future efforts will have to be carried out to identify the active molecule, the controlled spectrum insect pest, among other pertinent tests, to determine its potential use as a biopesticide.

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Palavras-chave

Controle biológico, Entomopatógenos, Glufosinato de amônio, Moléculas inseticidas, Saccharum spp., Transgênico

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