Toxicidade e criopreservação do sêmen de Astyanax altiparanae, utilizando dimetilsufóxido e metilglicol como crioprotetores

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Data

2019-02-27

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Universidade Estadual Paulista (Unesp)

Resumo

A criopreservação é uma tecnologia empregada para preservação de células, tecidos e embriões em baixas temperaturas. Para o desenvolvimento de tal tecnologia para a preservação seminal, é necessário o conhecimento sobre as características seminais da espécie que se pretende trabalhar, o estabelecimento de soluções diluentes que protegerão as células espermáticas e, dos respectivos protocolos de resfriamento, congelamento e descongelamento do sêmen criopreservado. As soluções crioproteroras devem ser atóxicas às células espermáticas, mantendo as características do fluido seminal. Assim, este trabalho teve por objetivos além de conhecer as características seminais do sêmen de Astyanax altiparanae, desenvolver um protocolo eficiente para a criopreservação seminal da espécie e sua utilização posterior. Para isso, exemplares adultos e maduros de A. altiparanae foram induzidos hormonalmente à reprodução com Ovopel®, sendo o sêmen coletado após 226 horas-grau em com auxílio de micropipetas. Deste foram avaliadas as características seminais como, osmolalidade, concentração espermática, motilidade espermática subjetiva e motilidade objetiva e vários outros aspectos de cinética dos espermatozoides pelo uso do CASA (Integrated Semen Analysis System). Foram avaliadas dez soluções crioprotetoras compostas por três bases diluentes A (5% de glicose + 10% gema de ovo), B (Bestville Thawing Solution (BTS®) a 5%) e C (5% de glicose), combinadas com um crioprotetor interno dimetilsulfóxido ou metilglicol, em concentrações de 10% e 15%. A eficiência destas soluções foi avaliada pela análise da motilidade espermática computadorizada. Para a criopreservação, o sêmen foi diluído na proporção de 1:25 (sêmen:diluente), envasado em palhetas de 0,25 mL e congelados em vapores de nitrogênio líquido. Também foi avaliada a integridade do DNA dos espermatozoides após descongelamento, pelo teste cometa. O sêmen apresentou-se translúcido, com consistência pouco viscosa, obtendo cerca de 30 µL de sêmen por macho. A osmolalidade média foi de 219±0,03 mOsm/kg, a concentração espermática média foi de 7,22±3,1 x109 espermatozoides/mL. A motilidade subjetiva média foi de 65%, com tempo de duração de motilidade de 33±2,2 segundos. Os valores médios obtidos pela análise do sêmen fresco com o ISAS® CASA foram: motilidade total 79,72±7,6%, motilidade progressiva 54,10±8,8% e motilidade não progressiva 25,62±8,5%, foram mensurados ainda as velocidades, VCL (47,28±15,8 µm/s), VSL (35,77±12,4 µm/s) e VAP (43,37±15,0 µm/s), LIN (75,5±6,1%), STR (82,6±4,3%), WOB (91,2±2,9%), ALH (1,3±0,1 µm) e BCF (6,9±0,3 Hz). Com relação a toxicidade os tratamentos T7 (DMSO 10% + C), T4 (MTG15% + A) e T6 (DMSO15% + B ) foram os que propiciaram melhores resultados pós diluição ao sêmen de A. altiparanae, apresentando valores s médios de motilidade total (MT) para T7 de 68,95±14,8%, T4 – MT de 61,77±4,6%, T6 - MT de 59,42±12,7%, não apresentando diferença significativa entre si. No que se refere a análise de motilidade pelos métodos subjetivo e objetivo (ISAS® CASA), o método objetivo registrou os maiores valores. Os processos de criopreservação e de descongelamento não foram eficazes em manter o sêmen viável, não sendo detectado nem motilidade, nem capacidade de fertilização em nenhum dos tratamentos testados. Com relação a integridade do DNA, nos tratamentos T1, T3, T5 e T6 foram detectados menores índices de danos.
Cryopreservation is a technology used to preserve cells, tissues and embryos at low temperatures. For the development of such seminal preservation technology, it is necessary to know the seminal characteristics of the species to be worked on, the establishment of diluent solutions that will protect the sperm cells, and the respective protocols of cooling, freezing and thawing of the cryopreserved semen. Cryoprotective solutions should be non-toxic to sperm cells, while maintaining seminal fluid characteristics. Thus, this work had as objectives besides knowing the seminal characteristics of Astyanax altiparanae, to develop an efficient protocol for the seminal cryopreservation of the species for its later use. For this, adult and mature A. altiparanae specimens were hormonally induced to Ovopel® reproduction, and the semen was collected after 226 hours-degree with the help of micropipettes. Seminal characteristics such as osmolality, sperm concentration, subjective sperm motility and objective motility, and several other aspects of sperm kinetics were evaluated using CASA (Integrated Semen Analysis System). Ten cryoprotectant solutions composed of three diluent bases A (5% glucose + 10% egg yolk), B Bestville Thawing Solution (BTS®) 5% and C (5% glucose), combined with a cryoprotectant internal dimethylsulfoxide or methylglycol, in concentrations of 10% and 15%. The efficiency of these solutions was evaluated by the analysis of the computerized sperm motility. For cryopreservation, the semen was diluted 1:25 (semen: diluent), packed in 0.25 mL vats and frozen in liquid nitrogen vapors. The integrity of sperm DNA after thawing was also evaluated by the comet test. The semen was translucent, with little viscous consistency, obtaining about 30 μL of semen per male. The mean osmolality was 219 ± 0.03 mOsm / kg, the mean sperm concentration was 7.22 ± 3.1 x109 spermatozoa / mL. The mean subjective motility was 65%, with a motility duration of 33 ± 2.2 seconds. The mean values obtained by analysis of fresh semen with ISAS® CASA were: total motility 79.72 ± 7.6%, progressive motility 54.10 ± 8.8%, (VLC (43.77 ± 15.4 μm/s) and VAP (43.37 ± 15.0 μm/s), LIN ( 75.5 ± 6.1%), STR (82.6 ± 4.3%), WOB (91.2 ± 2.9%), ALH (1.3 ± 0.1 μm) and BCF (6, 9 ± 0.3 Hz). As regards toxicity, T7 (DMSO 10% + C), T4 (MTG15% + A) and T6 (DMSO15% + B) treatments provided the best post-dilution results to A. altiparanae semen, presenting mean values of total motility (MT) for T7 of 68.95 ± 14.8%, T4 - MT of 61.77 ± 4.6%, T6 - MT of 59.42 ± 12.7%, with no significant difference between them. Regarding the analysis of motility by subjective and objective methods (ISAS® CASA), the objective method recorded the highest values. The cryopreservation and thawing processes were not effective in keeping the semen viable, in the treatments tested no motility and fertilization capacity were detected. Regarding DNA integrity, T1, T3, T5 and T6 treatments showed lower rates of damage.

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Palavras-chave

Characidae, Soluções crioprotetoras, Aquicultura, Qualidade seminal, Cryoprotectant solutions, Aquaculture, Seminal quality

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