Regionalização da resposta inflamatória aguda em modelos experimentais de epididimite murina: sinalização celular associada a receptores do tipo Toll (TLRs) e impacto na expressão gênica

Abstract

A epididimite, inflamação do epidídimo, é uma das doenças mais prevalentes do trato urogenital masculino, sendo um fator relevante de infertilidade masculina. Bactérias, como E. coli e S. aureus, que invadem o epidídimo via ascensão uretral retrógrada, constituem os principais agentes etiológicos da epididimite. Estudos demonstraram que estímulos inflamatórios e infecciosos produzem respostas diferentes entre as regiões do epidídimo (segmento inicial/cabeça, corpo e cauda), indicando a existência de microambientes inflamatórios e imunológicos distintos ao longo do órgão. O disparo da resposta epididimária contra infecções ocorre pela ativação de PRRs (pattern recognition receptors), expressos ao longo do órgão, através de PAMPs (pathogen-associated molecular patterns). Dentre os PRRs, destacamos os receptores do tipo Toll, tal como o TLR4 e TLR2/TLR6, que reconhecem o lipopolissacarídeo (LPS) e o ácido lipoteicoico (LTA), componentes da parede celular de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, respectivamente. Com o intuito de avançar no entendimento sobre o perfil da resposta regionalizada frente à inflamação aguda do epidídimo, testamos a hipótese de que este órgão modula a sinalização celular associada ao TLR4 e TLR2/TLR6, de acordo com a região do órgão e tipo estímulo inflamatório. Portanto, investigamos a expressão e regulação de genes chaves associados à via de sinalização TLR4 e TLR2/TLR6 em modelos murinos (in vivo e ex vivo) de epididimite induzida por UPEC (Escherichia coli uropatogênica), LPS e LTA, seguido de ensaios de ensaios moleculares (RT-qPCR e Western blot) e de estresse oxidativo (Griess e TBARS). Nossos resultados mostram que os genes associados à sinalização TLR (Tlr2, Tlr4, Tlr6, Cd14, Ticam1 e Traf6) foram positivamente regulados na cauda do epidídimo, mas não no segmento inicial, após a epididimite induzida por UPEC. Além disso, a ativação seletiva do TLR4, pelo LPS, e do TLR2/TLR6, pelo LTA levou à modulação diferencial da expressão dos transcritos Tlr2, Tlr4, Tlr6, Cd14, Myd88, Ticam1, Traf3 e Traf6 no segmento inicial e cauda do epidídimo. A inibição farmacológica dos fatores de transcrição AP1 e de NFKB preveniu diferencialmente as alterações induzidas por LPS e LTA no segmento inicial e na cauda do epidídimo, respectivamente. Além disso, demonstramos o rápido padrão de resposta do epidídimo com o início do aumento da produção de citocinas após a ativação dos fatores de transcrição. Adicionalmente demonstramos o perfil basal de enzimas com atividade antioxidantes nas regiões do epidídimo e apesar da regulação positiva do transcrito Nos2 frente ao desafio inflamatório com LPS os níveis de Nox e MDA não foram alterados. Em conjunto, nossos resultados sustentam a hipótese de que o epidídimo produz um ambiente inflamatório dinâmico de acordo com a região estimulada, além de fornecer evidências de que a regulação diferencial da via TLR para diferentes estímulos infecciosos e inflamatórios contribui para as repercussões da epididimite da região proximal e distal do órgão. A marcante regulação da sinalização TLR e seus alvos a jusante NFKB e AP1 durante a inflamação do epidídimo, pode abrir caminho para novos alvos farmacológicos para terapias adjuvantes da epididimite, com o objetivo de preservar a função tecidual e a fertilidade masculina.

Acute bacterial infection of the epididymis, epididymitis, is a common cause of scrotal pain in men of all ages. Epididymitis is a frequent immunological cause of male subfertility or infertility in men. Ascending canalicular infections with urogenital pathogens, such as E. coli and S. aureus, are the most common cause of epididymitis. Bacterial infections trigger immune responses through multiple mechanisms, including virulence factors and PAMPs (pathogen-associated molecular patterns)-mediated PRRs (pattern recognition receptors) activation. Among the PRRs, we highlight TLR4 and TLR2/TLR6. LPS (lipopolysaccharide) is a major PAMP of gram-negative bacteria and is recognized by TLR4, while LTA (lipoteichoic acid) is the major PAMPs of gram-positive bacteria recognized by TLR2/TLR6. In this study, we tested the hypothesis that the epididymis modulates the TLR-associated signaling pathways dependent manner of the epididymis-region and type inflammatory stimulus. For that, we evaluated the expression and regulation of key genes associated with the TLR4 and TLR2/TLR6 signaling in mice epididymitis models (in vivo and ex vivo), induced by UPEC, LPS, and LTA, followed by molecular (RT-qPCR and Western blot), and oxidative stress (Giress and TBARS) assays. Our results show that the UPEC infection up-regulated TLR-associated signaling pathways genes (Tlr2, Tlr4, Tlr6, Cd14, Ticam1, and Traf6) in the cauda epididymidis but not in the initial segment. Furthermore, selective activation of TLR4 by LPS and TLR2/LR6 by LTA led to differential modulation of the transcript levels that Tlr2, Tlr4, Tlr6, Cd14, Myd88, Ticam1, Traf3, and Traf6 in the initial segment and cauda epididymidis. Pharmacological inhibition of transcription factors AP1 and NFKB prevented LPS- and LTA-induced changes in the initial segment and cauda epididymidis, respectively. In addition, we show a fast response of the epididymis to the LPS challenge, increasing cytokine expression profile following transcription factors activation. The epididymis presents basal expression levels of enzymes with antioxidant activity and despite LPS-induced up-regulation Nos2 transcript, the levels of Nox and MDA were not changed. Our results support the hypothesis that the epididymis produces a dynamic inflammatory environment depending on the region stimulated, highlighting differential regulation of the TLR-associated pathway to infectious and inflammatory stimuli contributes to the outcomes in the proximal and distal epididymis. Given the tight regulation of TLR signaling and their downstream targets NFKB and AP1 during epididymal inflammation, they emerge as potential targets for adjuvant epididymitis therapies intending to preserve tissue function and male fertility.