Teses - Biotecnologia - IQ

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Otimização da produção de pigmento melanina por Aspergillus nidulans usando subprodutos agroindustriais como substrato para cultivo em frascos e biorreatores
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-06-13) Campanhol, Beatriz Silva ; Sponchiado, Sandra Regina Pombeiro ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Com o grande interesse das indústrias pelo uso de pigmentos naturais em substituição aos corantes sintéticos, os fungos filamentosos destacam-se como uma fonte mais vantajosa por produzirem uma gama de pigmentos com altos rendimentos por meio de estratégias econômicas e sustentáveis. Em estudos anteriores foi demonstrado que a melanina extraída do mutante MEL1 de Aspergillus nidulans exibe atividades antioxidante e anti-inflamatória, não apresentando efeito citotóxico ou mutagênico, e também mostrou ser eficiente na remoção de metais em solução. Estes resultados sugerem que este pigmento pode ser considerado um material promissor para utilização nas áreas da medicina, farmacosmética e ambiental. Neste contexto, o presente estudo teve como principal objetivo otimizar a composição do meio usando melaço, vinhaça e água de maceração de milho para o cultivo em fermentação submersa do mutante MEL1, visando uma maior produção do pigmento melanina com menor custo. Também foi avaliada a produção de melanina nos reatores em escala de bancada, tanque agitado e coluna de bolhas. Com os resultados obtidos nos planejamentos experimentais, realizados em frascos, foi possível observar que a adição de 0,81 % (v/v) de vinhaça e 1,62 % (m/v) de glicose ao meio de cultura resultou na produção de 291,74 ± 4,59 mg de melanina não purificada por g de biomassa, o que equivale a um aumento de 88% (acréscimo de 136,59 mg de melanina não purificada por g de biomassa) comparado as condições antes da otimização. Na condição otimizada, a produção da melanina purificada foi de 225,39 ± 4,52 mg de melanina purificada por g de biomassa, equivalendo a um aumento de 125% (acréscimo de 125,07 mg de melanina purificada por g de biomassa) quando comparado as condições antes da otimização. Os resultados obtidos nos biorreatores mostraram que o cultivo em reator de coluna de bolhas resultou em maior produção de melanina não purificada (271,56 ± 9,37 mg g-1 de biomassa) quando comparado ao cultivo em tanque agitado (231,11 ± 21,09 mg g-1 de biomassa), chegando a uma produção total de 1,2 g L-1. Portanto, o cultivo do mutante MEL1 em biorreator de coluna de bolhas, utilizando o meio de cultura contendo glicose e vinhaça como substrato de baixo custo, torna o processo de produção da melanina pelo mutante MEL1 de A. nidulans economicamente viável para futuras aplicações biotecnológicas.
Avaliação do uso da hemoglobina extracelular de Amynthas gracilis (HbAg) na elaboração de detectores óticos de contaminação ambiental
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-07-07) Souza, Claudemir Oliveira ; Santiago, Patrícia Soares ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Diversos estudos com enzimas e até mesmo hemoproteínas tem mostrado um grande avanço na fabricação de biossensores para monitorar e quantificar moléculas em diferentes meios. Dentre as hemoproteínas, as hemoglobinas gigantes são uma classe que detém características muito interessantes para o uso neste tipo de ferramenta biotecnológica, como é o caso do biossensoriamento de metais pesados. No presente trabalho, foi verificada a interação da hemoglobina extracelular de Amynthas gracilis (HbAg) com os metais cobre, cádmio e zinco, visando um protótipo de biossensor de metais pesados. Os ensaios biofísicos em solução da HbAg frente aos metais cobre, cádmio e zinco foram monitorados através de diversas técnicas espectroscópicas. A imobilização da HbAg foi realizada através da técnica de Layerby- Layer (LBL) com o auxílio do polímero polietilenoimina (PEI) em quartzo para observar as mudanças espectrais no UV-Vis, e em eletrodo de carbono vítreo, para avaliação das alterações eletroquímicas da HbAg frente a adição dos metais. Além disso, a morfologia dos filmes também foi verificada com microscopia eletrônica de varredura e microbalança de cristal de quartzo. Verificou-se que a HbAg não se oxida na presença de cádmio e, frente ao zinco, a oxidação parcial é visualizada acima de 20 μmol L-1, além disso, nesta concentração, a hemoglobina sofre dissociação e agregação. A partir de 30 μmol L-1 de cobre em pH 7,0 a HbAg é oxidada, dissocia-se e perde parte de sua estrutura secundária. Em pH 5,0, sofre maior oxidação. Foi observado que o processo de imobilização não altera as propriedades óticas da hemoproteína e que, a partir da interação de 20 μmol L-1 do metal cobre sobre as bicamadas PEI/HbAg por 8 minutos, há um significativo deslocamento da banda de Soret, deslocando o máximo da banda de Soret para 409 nm na concentração de 70 μmol L-1. Ademais, a interação do eletrodo contendo PEI/HbAg com cobre, cádmio e zinco, monitorados por voltametria cíclica, mostraram curvas semelhantes entre si com saturação do eletrodo em torno de 10 μmol L-1 dos metais. Um estudo comparativo entre a HbAg e a hemoglobina humana (HHb) imobilizada no quartzo foi realizado com o intuito de verificar se a detecção com a HbAg seria melhor monitorada quando comparada com a HHb. Porém, não foram observadas alterações significativas entre os dois sistemas. Todavia, através dos estudos óticos foi possível propor que a HbAg é sensível ao cobre e zinco nas concentrações analisadas em solução e desta forma a potencialidade da HbAg como sensor ótico foi verificada. Não há seletividade da molécula quando utilizada em sensor eletroanalítico nas condições analisadas.
Abordagens bionalíticas baseadas em peptídeo recombinante selecionado por Phage Display visando a detecção e caracterização de câncer de mama
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-06-02) Alves, Rafael da Fonseca ; Sotomayor, Maria Del Pilar Taboada ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O câncer de mama (CM) é o tumor maligno mais comum na população mundial. Assim, métodos mais precisos e que detectem a doença precocemente são necessários, de modo que técnicas inovadoras como o Phage Display (PD) vêm sendo amplamente exploradas. Nesse contexto, a construção de sensores biológicos e imunoensaios do tipo ELISA baseados em peptídeos ligantes selecionados por PD se mostra como uma promissora alternativa no desenvolvimento de novas abordagens bioanalíticas, sendo que estas se destacam pela sensibilidade e seletividade. Esta Tese, portanto, em consonâncias com as atuais demandas da área oncológica, objetivou desenvolver novas metodologias bioanalíticas voltadas para o CM. No Capítulo II, uma nova matriz para o acoplamento de biomoléculas na superfície de eletrodos de grafite de lapiseira (PGEs) foi gerada através da modificação eletroquímica com um novo material derivado do ácido 3-(3-aminofenil)propiônico (3-3-AAFP). Foram realizadas caracterizações eletroquímicas e morfológicas, sendo proposto o mecanismo de eletropolimerização do poli(3-3-AAFP), no qual os grupos carboxilato são mantidos na estrutura do polímero formado. Um novo teste ELISA e um biossensor eletroquímico, foram testados com o soro de pacientes diagnosticados com CM ou doença benigna da mama (DBM), visando detectar antígenos circulantes, ambos utilizando o peptídeo Biotina-H2 ou Biotina-C3. Foram plotadas curvas ROC, sendo para cada resultado significativo e realizados os cálculos da análise de desempenho, para os testes ELISA e o biossenssor, respectivamente. O peptídeo Biotina-H2 apresentou um desempenho inferior (AUC de 0,677 e 0,806) comparado ao peptídeo Biotina-C3 que, além de manter o potencial diagnóstico (AUC de 0,771 e 0,951), caracterizou CM luminal de acordo com o status p53 (AUC de 0,886 e 0,748) e a expressão de HER2 (AUC de 0,748 e 0,833), sendo o biossensor uma melhor estratégia quando comparado ao teste ELISA. Além disso, no Capítulo III, por meio de um estudo proteômico, foram identificados 38 possíveis alvos para o peptídeo Biotina-C3, sendo estes presentes em membrana plasmática e membranas de organelas celulares, principalmente de mitocôndrias. Visando a detecção e caracterização de exossomos derivados de linhagens celulares de CM, ensaios de citometria de fluxo foram conduzidos. Para isso, exossomos imobilizados diretamente em partículas magnéticas e indiretamente em partículas magnéticas modificadas com anticorpos anti-CD9, anti-CD63 e anti-CD81 foram utilizados para validar a capacidade do peptídeo Biotina-C3 de se ligar aos exossomos. Estes também foram detectados por magneto-ELISA e por biossensor eletroquímico magnético, com LODs menores para a linhagem MCF-7, sendo (LOD magneto-ELISA de 330 exossomos μL−1) e (LOD Biossensor de 175 exossomos μL−1) em comparação com as outras linhagens celulares. A detecção de exossomos derivados da linhagem Luminal (MCF-7), em soro humano foi realizada com sucesso, e a combinação de partículas magnéticas modificadas com anti-CD63, seguida da detecção baseada no peptídeo Biotina-C3 proporcionou resultados promissores em termos de especificidade e recuperação, para o teste ELISA (108,8%) e para o Biossensor (111,9%). Estas novas abordagens bionalíticas permitirão o desenvolvimento de novas plataformas rápidas e inovadoras para a caracterização do CM e seus subtipos moleculares.
Estudo funcional e rastreamento de novos inibidores da enzima desoxi-hipusina sintase de organismos eucariotos patogênicos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-30) Silva, Suélen Fernandes ; Zanelli, Cleslei Fernando ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A enzima desoxi-hipusina sintase (DHS) catalisa a primeira etapa da modificação póstraducional do fator de tradução de eucariotos 5A (eIF5A), que é a única proteína conhecida a conter o aminoácido hipusina, proveniente dessa modificação. Ambos eIF5A e DHS são essenciais para a viabilidade celular em eucariotos e a inibição de DHS poderia ser uma estratégia promissora para o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas contra doenças tropicais negligenciadas (DTNs). Nesse trabalho, nós buscamos por inibidores das enzimas DHS de Leishmania major e Plasmodium vivax, organismos causadores de leishmaniose cutânea e malária, respectivamente. Primeiramente foi realizada a triagem virtual da biblioteca de compostos do banco de dados ChEMBL- NTD. Foram selecionados 9 candidatos, que foram testados em um ensaio automatizado usando linhagens de Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificadas, contendo o gene DHS endógeno substituído pelos genes DHS de H. sapiens (HsDHS), L. major (LmDHS) ou P. vivax (PvDHS). Dos 9 compostos, três apresentaram resultados promissores in vivo a uma concentração de 100 µM, sendo que o composto GNF-Pf-744 reduziu 65% do crescimento da linhagem dys1Δ::PvDHS, ChEMBL1081521 inibiu 37% dys1Δ::LmDHS e GNF-Pf-3738 inibiu 27% de crescimento de dys1Δ::PvDHS e 33% de dys1Δ::LmDHS, nessa concentração. A citotoxicidade geral desses compostos foi analisada nas linhagens de mamífero MCF7 e HepG2 e apenas o composto GNF-Pf- 3738 foi tóxico em concentrações de até 100 µM. Além disso, foi realizado um rastreamento de 400 compostos da coleção The Pathogen box em S. cerevisiae, do qual o composto, MMV676584 reduziu o crescimento da levedura dys1Δ complementada por PvDHS. Um ensaio bioquímico in vitro, baseado em fluorescência, foi padronizado para a confirmação da enzima DHS como alvo, no entanto a maioria dos compostos foram fluorescentes no comprimento de onda testado e não puderam ser testados por esse ensaio. Assim, um ensaio de detecção da hipusinação por western blot foi padronizado para confirmação dos hits, no qual os compostos GNF-Pf-744 e MMV676584 a 100 µM reduziram significativamente em 60 e 70% a taxa de eIF5A hipusinado por PvDHS. Os novos ligantes de DHS encontrados nesse trabalho, GNF-Pf-744 e MMV676584, podem ser pontos de partida para o desenvolvimento de novos inibidores para a proteína DHS dos parasitas estudados.
Imunossensor impedimétrico para detecção de Candidatus Liberibacter Asiaticus em citros
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-14) Silva, Lucas Moreira ; Yamanaka, Hideko ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A citricultura é um dos setores mais bem organizados da agroindústria brasileira, dispondo de fundações empresariais de assessoria e monitoramento da produção e da qualidade dos citros. Atualmente a produção brasileira está concentrada no denominado de cinturão citrícola de São Paulo e Minas Gerais, região geográfica que engloba 481 municípios e 12 mil fazendas, totalizando uma área plantada de mais de 400 mil hectares, sendo responsável por 60% da produção mundial de suco de laranja. Entanto, a citricultura vem enfrentando alguns desafios em função da disseminação de diferentes doenças, das quais podemos ressaltar o Huanglongbing (HLB) também nomeada “greening”, que é provocada pelas bactérias Candidatus Liberibacter asiaticus e Candidatus Liberibacter americanus as quais são transmitidas para as plantas pelo psilídeo Diaphorina citri. A detecção de plantas contaminadas com “greening” no pomar ocorre de forma visual e geralmente subjetiva e os métodos laboratoriais existentes demandam tempo de análise e elevado custo financeiro. Desta maneira, no presente trabalho desenvolveu-se um imunossensor impedimétrico seletivo para a detecção e determinação de HLB em amostras de citros. O anticorpo anti-HLB, obtido comercialmente a partir da proteína de membrana externa (OMP), foi imobilizado sobre nanopartícula magnética previamente sintetizada e caracterizada. O anticorpo devidamente imobilizado foi colocado em contato com as diferentes amostras de extratos de folhas de plantas cítricas, após a reação de afinidade com o antígeno realizou-se a etapa de lavagem do material para minimizar o efeito de matriz. O monitoramento da reação de afinidade foi efetuado por espectroscopia de impedância eletroquímica, empregando como eletrodo de trabalho o carbono vítreo contendo em seu interior um imã de neodímio. O dispositivo desenvolvido distingue as amostras positivas ao HLB das amostras negativas ao HLB e das positivas ao CTV. Os resultados obtidos pelo imunossensor impedimétrico corroboraram os dados alcançados pela técnica equivalente a técnica “padrão ouro” qPCR.
Avaliação da resposta fisiológica de Fusarium sp. exposto a extratos brutos, frações e amida isolada de espécies do gênero Piper
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-02-03) Amancio, Ilca Fabiane Nogueira ; Silva, Regildo Marcio Gonçalves ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As espécies do gênero Piper caracterizam-se por apresentar alta diversidade química relacionada as diferentes classes de metabólitos secundários, tais com amidas isobutílicas, piperidínicas e pirrolidínicas, cromenos, derivados prenilados do ácido benzoico, flavonoides, lignanas, fenilpropanoides, terpenos, entre outros. Várias amidas foram isoladas de espécies do gênero Piper e estas atraem interesse para aplicação agrícola, pois tem demonstrado propriedades inseticidas e fungicidas. Piper arboreum e Piper tuberculatum contém amidas que apresentaram atividade antifúngica contra o fungo do gênero Cladosporium. Diante disso este estudo teve por objetivo avaliar o potencial antifúngico dos extratos brutos, frações e amida isolada de P. arboreum e P. tuberculatum sobre cultura in vitro de fungo do gênero Fusarium sp. Investigou o mecanismo de ação antifúngico por meio da determinação da atividade pró e oxidativa dos extratos, frações e compostos isolados sobre cultura de Fusarium sp. exposta aos mesmos, por meio da determinação das enzimas antioxidantes. Na avaliação antifúngica por meio de cultura em placas os extratos e frações inibiram o crescimento das culturas expostas aos mesmos. Estes, resultados corroboram com os ensaios de microduluição e fermentação submerça, destacando-se a espécie P. tuberculatum. Os ensaios pró-oxidantes e de determinação das enzimas antioxidantes em cultura de Fusarium sp. expostas aos extratos, fração e amida isolada de P. tuberculatum resultaram em um possível mecanismo de ação para estes compostos, pois tanto a ação pró como a oxidativa foi aumentada nas culturas tratadas, o que resultou na diminuição considerável do crescimento micelial e da biomassa final da cultura. Perante o exposto é possível concluir que as espécies do gênero Piper avaliadas neste estudo apresentaram potencial para inibição do crescimento micelial em cultura de Fusarium sp. Os extratos, frações e amida demonstraram atividades antifúngicas e/ou fungiostáticas, sendo a atividade pró-oxidativa e oxidante possivelmente seu principal mecanismo de ação.
Perfil transcricional comparativo de folha e raiz de Monteverdia ilicifolia para a biossíntese de terpenos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-12-20) Santoni, Mariana Marchi ; Zanelli, Cleslei Fernando ; Furlan, Maysa ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As plantas produzem uma grande diversidade de compostos denominados metabólitos secundários (MS), importantes para a sua sobrevivência. Evolutivamente, originam-se como resposta ecológica a competição, defesa ou sinalização e sua biossíntese é um processo altamente regulado por enzimas específicas. Devido ao seu amplo espectro de bioatividades, os MS apresentam aplicações medicinais, mas, como a síntese química não é economicamente viável, a extração das plantas é única opção. Diferentes estratégias biotecnológicas são aplicadas para melhorar o rendimento da bioprodução desses compostos, no entanto, este processo limitado é pelo pouco conhecimento sobre vias biossintéticas e regulatórias. A espécie Maytenus ilicifolia, atualmente, Monteverdia ilicifolia, uma planta medicinal tradicional, é brasileira e pertence à família Celastraceae. Conhecida como "espinheira santa", apresenta três classes principais de MS: sesquiterpênicos, flavonóides e quinonametídeos, que são produzindo tanto em folhas como raízes. O objetivo deste trabalho foi identificar os genes responsáveis pela biossíntese dos MS de M. ilicifolia e fatores de regulação destas rotas, pelo sequenciamento de novo do transcriptoma desta espécie. Quatro bibliotecas de cDNA foram preparadas a partir de folhas e raízes. O transcriptoma de novo incluiu 109.982 sequências que capturou 92% dos ortólogos da base “BUSCO”. Os transcritos apresentaram um comprimento médio de 737pb e um conteúdo GC de aproximadamente 42%. As análises de anotação funcional identificaram homologia para 44,8% dos transcritos. Em termos de expressão comparativa, 67.625 sequencias foram expressas em ambos os órgãos, mas 1.044 e 1.717 sequências foram diferencialmente expressas na raiz e na folha, respectivamente. Quanto aos MS, genes codificadores para enzimas envolvidas na biossíntese de monoterpenos, isoflavonoides foram identificadas nas raízes e para as folhas, biossíntese de flavanoides e biossíntese de alcaloides. Em termos de regulação das vias, 191 transcritos foram anotados como fatores de transcrição, sendo 12 diferencialmente nas folhas e três nas raízes. Foram identificadas enzimas envolvidas na biossíntese de terpenos, incluindo as vias do mevalonato (8) e do metileritritol-fosfato (9). Adicionalmente, 126 transcritos foram atribuídos como codificadores para enzimas CYP450. Por fim, a escolha da raiz e da folha para a análise comparativa do transcriptoma facilitou a identificação dos genes envolvidos na biossíntese de MS, uma abordagem amplamente utilizada em plantas.
Análise da expressão dos fatores de crescimento FGF, VEGF e TGF associados ao reparo dérmico estimulado pelo látex natural (Hevea brasiliensis) e seu efeito na taxa de pulsação em Lumbriculus variegatus
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-12-16) Paulino, Cristiane Garcia ; Herculano, Rondinelli Donizetti ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Estudos recentes revelam a eficácia do uso do látex natural, extraído da seringueira Hevea brasiliensis, como agente cicatrizante e como uma matriz carreadora de diversos produtos com efeitos farmacológicos. Por ser um evento sistêmico, a cicatrização abrange uma gama de fatores que precisam interagir entre si para que haja uma evolução de forma eficiente. Tendo em vista a capacidade angiogênica e cicatrizante do látex, esta pesquisa investigou através de análises moleculares a expressão dos fatores de crescimento FGF, VEGF e TGF presentes no látex, em cultura de fibroblastos 3T3. Dentre os fatores de crescimento que influenciam o crescimento dérmico, podemos destacar o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), fator de crescimento transformador beta (TGF-β) e o fator de crescimento fibroblástico (FGF), que estimulam a proliferação celular, a produção de colágeno e de outros elementos da matriz celular, favorecendo o processo de cicatrização. Conforme as análises de FTIR, os componentes identificados presentes na membrana de látex, na fração F1 e no soro foram identificados pertencentes ao isopreno, principal constituinte do látex, como para os grupos funcionais. A amostra do soro apresentou maior discrepância evidenciando que a parte proteica pode estar agindo como indutor de angiogênese. O ensaio hemolítico das amostras, fração F1, soro e a membrana de látex não apresentaram um alto grau de hemólise significativa no período observado, demonstrando assim ser um biomaterial hemocompatível. Nas condições experimentais utilizadas, evidenciou-se baixo teor de fenóis e capacidade antioxidante da fração F1, soro e membrana de látex. Os resultados obtidos nos ensaios com os Blackworms indicam que as frações F1, soro e membrana de látex, nas concentrações testadas, tiveram efeito no sistema circulatório alterando a taxa de pulsação dos Blackworms. A fração F1 e o soro do látex, na concentração de 0,01%, no cultivo de fibroblastos e macrófagos apresentaram melhor viabilidade celular no período de 72h de incubação. A membrana de látex apresentou viabilidade celular superior em todos os períodos de incubação quando comparados ao controle, porém seus resultados foram mais satisfatórios no intervalo de 72h. Os resultados encontrados da análise de expressão gênica confirmaram que houve aumento significativo nas expressões dos genes VEGF, FGF e TGF na membrana e nas frações F1 e soro do látex quando comparadas ao controle, evidenciando o potêncial angiogênico dessas amostras. Este mecanismo de Engenharia Tecidual pode ser um dos procedimentos para regeneração dérmica no futuro.
Avaliação de efluentes citrícolas na geração de biohidrogênio e co-produtos de valor agregado em reatores anaeróbios em batelada
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-10-25) Silva, Daiana Camila da ; Maintinguer, Sandra Imaculada ; Pires, Lorena Oliveira ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Os resíduos citrícolas são uma preocupação ambiental importante para as indústrias brasileiras, uma vez que o Brasil é o maior produtor e exportador de suco laranja para o mundo. Entre as possibilidades de valorização e reuso deste resíduo, o processo fermentativo é uma alternativa promissora na geração de energia renovável, como biogás, álcoois e ácidos graxos voláteis. Nesse sentido, o objetivo deste estudo foi utilizar o efluente bruto citrícola (EC) como substrato na geração de hidrogênio, ácidos graxos voláteis e álcoois a partir da obtenção de uma cultura mista autóctone de bactérias anaeróbias e compará-la com culturas puras de bactérias fermentativas e lodo granular metanogênico pré-tratado. A cultura mista foi submetida em ensaios com diferentes fontes de carbono, dos quais se destacaram crescimento microbiano e detecção de hidrogênio em glicose, sacarose e frutose. Posteriormente, a cultura mista e culturas puras fermentativas (inóculo 1-Clostridium acetobutylicum ATCC824 e inóculo 2-Clostridium beijerinckii ATCC10132) foram inoculadas em meios de cultivo específicos para Clostridium sp. (PYG, RCM, TYA, MITRA) em reatores anaeróbios em batelada, mantidos sob agitação e modo estático. Produções de etanol e ácidos graxos voláteis mais elevados foram verificadas nos reatores com os meios de cultivo RCM e PYG. A seguir foram realizados ensaios em reatores alimentados com glicose, com gerações de hidrogênio e butanol para as culturas puras (inóculos 1 e 2), além de gerações de etanol para a cultura mista de bactérias anaeróbias (inóculo 3). Em reatores alimentados com efluente citrícola, foram obtidos 21,2; 15,7 e; 37,6 mmol H2 L-1 com os inóculos 1; 2 e 3, respectivamente. Proporções crescentes foram adicionadas em reatores anaeróbios em batelada inoculados com culturas puras e cultura mista para produção de hidrogênio e co-produtos. Na condição 1(0% EC+100% meio RCM), com os inóculos 1 e 2 obtiveram-se gerações de butanol e com o inóculo 3 foi verificada produção elevada de etanol. Na condição 2 (20% EC+80% meio RCM), as produções de hidrogênio foram de 11,9; 9,4 e 12,5 mmol H2 L-1 para os inóculos 1, 2 e 3, respectivamente. Entretanto, na condição 3 (50%EC+50% meio RCM), a produção teve um declínio com valores de 4,1; 5,9 e 11,5 mmol H2 L-1 para os inóculos 1, 2 e 3, respectivamente. Na condição 4 (80%EC+20% meio RCM) foram verificadas gerações de 12,4; 15,0 e 13,1 mmol H2 L-1 para os inóculos 1, 2 e 3, respectivamente. Porém, na condição 5 (100% EC+0% meio RCM), ocorreu a baixa produção de hidrogênio com valores de até 4 mmol H2 L-1 no inóculo 3. Foi realizado teste com mistura das culturas puras (50% inóculo 1+50% inóculo 2), nos ensaios I (80% EC + inóculo 1 + inóculo 2) e ensaio II (100% EC + inóculo 1 + inóculo 2) e ensaio III (100% EC + lodo granular metanogênico pré-tratado). As produções de hidrogênio nos ensaios I, II e III foram 17,7; 16,5 e 7,6 mmol H2L-1, respectivamente, comprovando que a adição das culturas puras elevaram as produções de hidrogênio. A cultura mista apresentou abundâncias relativas de bactérias fermentativas distribuídas, principalmente, nos gêneros Clostridium, Bacillus e Lactobacillus com abundâncias relativas de 13,65%, 20,44% e 10,61%, respectivamente provavelmente envolvidas nas gerações de hidrogênio e etanol verificadas. A eficiência da digestão anaeróbia no tratamento de efluentes agroindustriais como da laranja foi comprovada no re-aproveitamento e na geração de biocombustíveis.
Otimização da produção de etanol a 42°C utilizando uma co-cultura de Saccharomyces cerevisiae e Pichia kudriavzevii em batelada alimentada
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2014-06-06) Gallardo, Jéssica Carolina Medina ; Laluce, Cecília ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O processo industrial de produção de etanol combustível é realizado sob condições não estéreis, portanto diferentes espécies de leveduras provenientes da matéria-prima e/ou do próprio ambiente podem ser encontradas no processo de fermentação. Geralmente, a temperatura nas dornas industriais é mantida ao redor de 32°C a 35°C, no entanto, devido ao curto tempo de fermentação, o resfriamento nem sempre é suficientemente eficaz na remoção de calor, atingindo temperaturas de até 40°C. Assim, uma levedura capaz de fermentar a temperaturas acima daquelas toleradas por Saccharomyces cerevisiae, levedura utilizada como inóculo nas fermentações industriais, pode ser útil na produção de etanol durante períodos de elevação de temperatura, especialmente em países de clima tropical como o Brasil. Issatchenkia orientalis é uma levedura não-Saccharomyces capaz de converter glicose e frutose em etanol a temperaturas tão altas quanto 42°C, é encontrada em processos industriais de fabricação de pães e bebidas. O presente trabalho visou a produção de etanol a partir de melaço de cana-de-açúcar a 42°C utilizando uma cultura mista das leveduras S. cerevisiae e P. kudriavzevii . Para atingir este objetivo, inicialmente, padronizaram-se as condições de fermentação em batelada alimentada a 42°C. Em ciclos únicos de fermentação, o inóculo misto de S. cerevisiae e P. kudriavzevii (24 g/L, proporção inicial 1:3, m/v) produziu 78,76±2,08 g/L de etanol com uma produtividade de 9,85±0,29 g/L/h, rendimento teórico igual a 91,97% e (Y(P/S)) de 0,47±0,01 g/g após 8 h de fermentação. A seguir foi estudada a fermentação em batelada alimentada com reciclo de células e revitalização das células entre os ciclos de fermentação. A suplementação do meio de revitalização com um coquetel de sais, não teve efeito sobre o acúmulo da biomassa, a viabilidade e a produção de etanol. Por outro lado, quando uma fonte de nitrogênio orgânico (lisado celular) foi adicionado ao meio de revitalização observou-se um aumento significativo no acúmulo de biomassa, porém sem melhoras no rendimento do processo. Já que as duas condições de revitalização estudadas não levaram a resultados relevantes em relação à produção de etanol e ao aumento da viabilidade, decidiu-se realizar experimentos de reciclo sem revitalização das células entre os ciclos. Estes experimentos confirmaram que é possível reciclar as células da cultura mista durante 5 ciclos consecutivos a 40°C e 42°C sem perdas significativas na produção de etanol, (YP/S) e viabilidade. Por fim, foi comprovada a tolerância da cultura mista a um coquetel de inibidores presentes nos hidrolisados de bagaço de cana e confirmou-se a resistência de P. kudriavzevii aos ácidos lático e acético e ao etanol a temperaturas elevadas (40°C). Estes resultados representam uma inovação tecnológica para o setor sucroalcooleiro, uma vez que a utilização da co-cultura de S. cerevisiae e P. kudriavzevii aumentaram a produção de etanol em condições de estresse. Entretanto, ensaios em escala piloto são necessários para validar este processo utilizando volumes maiores de meio.
Uso de técnicas simples e da análise genética para determinação de persistência e dominância de leveduras em processos fermentativos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2015-03-13) Masiero, Maria Olivia Campos ; Laluce, Cecília ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A levedura Saccharomyces cerevisiae é a mais utilizada em processos fermentativos, pois é capaz de converter eficientemente os açúcares presentes no meio de cultivo em álcool. Esta conversão permite a produção de biocombustíveis como o etanol, e a produção de bebidas alcoólicas, como vinho, cerveja e cachaça. Durante a fermentação, as leveduras são expostas a estresses alcoólico, osmótico, nutricional, térmico e ácido. Esses estresses induzem o aparecimento de mutações, causando instabilidade no processo fermentativo. O reciclo celular durante as fermentações sucessivas agravam o ecossistema do processo através de contaminação por bactérias e consequentemente competição entre espécies e pelo substrato, porém o reuso celular diminui o tempo e o custo das fermentações. A garantia de que o inóculo starter estará presente durante as fermentações é outro aspecto de relevância nas indústrias, pois a dominância e persistência da levedura inoculada garante maior reprodutibilidade do processo. Técnicas simples de monitoramento de leveduras em processos fermentativos ainda não foram bem definidas por isso, um screening de corantes em meios sólidos e meios de indução de esporulação foram utilizados na busca de identificar instabilidade fenotípica das linhagens inoculadas durante as várias etapas do processo fermentativo. A partir desse screening, obteve-se o desenvolvimento de meios sólidos que permitiram identificar diferentes linhagens de leveduras com base nas diferentes pigmentações das colônias. O seu uso durante as fermentações simples e mistas permitiu monitorar a estabilidade fenotípica das leveduras inoculadas bem como acompanhar a proporção de linhagens dominantes e persistentes no processo. Essa técnica de monitoramento foi aplicada aos processos fermentativos de produção de etanol a partir do melaço de cana-de-açúcar e de produção de vinho a partir de mosto natural de uva. A sua capacidade de monitorar diferentes linhagens inoculadas em consórcio e em diferentes processos fermentativos foi validada através da técnica molecular interdelta. Comparações entre os perfis polimórficos das culturas estoques com os das colônias crescidas nos meios sólidos cromogênicos resultaram em bandas idênticas. Com isso, a identificação de leveduras por meio da coloração de colônias demonstrou ser altamente viável para elucidar a dinâmica populacional quanto à persistência e dominância de linhagens starters em processos fermentativos.
Caracterização funcional, bioquímica e na resposta a estresse das ATPases RVB-1 e RVB-2 e da ciclina PCL-1 no fungo filamentoso Neurospora crassa
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-25) Campanella, Jonatas Erick Maimoni ; Bertolini, Maria Celia ; Freitas, Fernanda Zanolli ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O fungo Neurospora crassa está entre os organismos mais bem compreendidos, sendo um fungo filamentoso amplamente utilizado como organismo modelo. Em nosso laboratório, diferentes proteínas foram previamente identificadas como reguladoras do metabolismo de glicogênio em diferentes condições de crescimento. Neste trabalho, algumas destas proteínas foram mais detalhadamente caracterizadas do ponto de vista bioquímico e funcional. A função da ciclina PCL-1, anteriormente identificada como uma proteína parceira da quinase PHO85-1, foi mais amplamente investigada mostrando funções adicionais à regulação do ciclo celular e metabolismo de glicogênio. Foi demonstrado que esta ciclina atua também na resposta a estresse, principalmente aquele induzido por altas concentrações de cálcio extracelular, possivelmente através da fosforilação de CRZ-1, um fator de transcrição responsivo a cálcio. O conjunto de resultados mostra o papel multifuncional desta ciclina no fungo N. crassa, diferente da levedura Saccharomyces cerevisiae, na qual ciclinas de uma família são direcionadas às mesmas funções celulares. A proteína RVB-1, anteriormente identificada como capaz de se ligar ao promotor gsn, foi também amplamente caracterizada neste trabalho. RVB-1, juntamente com sua paráloga RVB-2, pertence à família AAA+ ATPases (ATPases Associated with Diverse Celular Activities) conhecidas por interagir com múltiplos complexos proteicos incluindo remodeladores da cromatina e amplamente associadas ao desenvolvimento celular e câncer. Ambas as proteínas são essenciais ao fungo, tem localização nuclear e influenciam no seu desenvolvimento e produção de metabolitos secundários. O complexo RVB-1/RVB-2 foi produzido na forma recombinante em E. coli e caracterizado quanto aos aspectos estruturais e bioquímicos. O complexo mostrou atividade ATPase, capacidade de se ligar a fragmentos de DNA e apresentou diferentes formas oligoméricas em solução, sendo que a presença dos nucleotídeos ATP/ADP influencia no estado de oligomerização. A expressão de ambas as proteínas é modulada por diferentes estresses e ensaios de imunoprecipitação da proteína RVB-1 levaram à identificação de numerosas proteínas parceiras. Algumas interações foram caracterizadas neste trabalho. A interação in vivo com a proteína glicogenina (GNN), juntamente com a redução no conteúdo de glicogênio nas linhagens mutantes rvb-1het e rvb-2het indicou a participação do complexo na regulação do metabolismo de glicogênio. A interação in vitro com a parceira shugoshin (SGO-1), descrita como guardiã da resposta ao estresse térmico em mamífero, foi demonstrada comprovando o papel na resposta ao estresse. Finalmente, linhagens do fungo mutantes em componentes de complexos de remodelagem de cromatina, identificados como parceiros, são severamente sensíveis a estresse, evidenciando um papel funcional ainda não descrito para estas proteínas: a participação na resposta a estresse.
Estudos biofísicos da hemocianina do camarão Macrobachium acanthurus (HcMac) na presença de agentes caotrópicos e atividade biológica
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-09-15) Ramos, Lierge ; Santiago, Patrícia Soares ; Santos Filho, Norival Alves ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As hemocianinas (Hcs) são grandes proteínas extracelulares responsáveis por inúmeras funções em artrópodes e moluscos. Representam cerca de 50 – 90% da hemolinfa, e tem como principais funções, o transporte de O2 e atuar no mecanismo de defesa imunológica. Em geral, as Hcs mantem sua integridade funcional e estrutural em uma ampla faixa de temperatura (entre -20 e 90ºC) e apresentam atividade fenoloxidase (PO) latente quando o animal é exposto a condições de estresse. Em artrópodes, as Hcs apresentam-se na forma de seis cadeias monoméricas agregadas, na forma de um hexâmero ou oligohexâmeros contendo até oito hexâmeros (8 × hexâmeros). Assim, o objetivo geral deste projeto de doutorado foi purificar, caracterizar, avaliar atividade biológica e PO da Hc do camarão Macrobrachium acanthurus (HcMac). Para estes estudos foram realizados cromatografia líquida de exclusão molecular, eletroforese monodimensional SDS-PAGE, AUC (do inglês Analytical Utracentrifugation), MALDI-TOF-MS (do inglês Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry), medidas espectroscópicas variando o pH, concentração de ureia e SDS (dodecil sulfato de sódio), e estudos de atividade PO e antimicrobiana. Os resultados dos experimentos de SDS-PAGE, AUC e MALDI-TOF-MS indicam que a HcMac é formada por cadeias polipeptídicas de 75 - 76 kDa formando uma estrutura de 450 kDa, ou seja, um hexâmero é composto por 6 cadeias monomérica de 75 KDa (1×hexâmero). As medidas UV-vis mostraram que a afinidade do centro di-cobre pelo oxigênio é dependente do valor de pH. Os resultados de emissão de fluorescência indicaram alterações na estrutura terciária da proteína devido às mudanças do valor de pH do meio, sendo que este influenciou na exposição dos resíduos de Triptofano ao solvente. Através das análises de intensidade de espalhamento de luz (LSI – do inglês Ligth Scathering Intensity) medidas no espectrofluorímetro foi possível sugerir que a HcMac apresenta ponto isoelétrico entre 4,3 e 5,3, assim como a hemocianina de outros camarões. A ureia induziu o processo de desnaturação, mas em pH 7,0 a HcMac demonstrou ser mais estável e foi necessário uma concentração maior de desnaturante em relação ao pH 5,0. A ureia e o SDS reduziram a intensidade de fluorescência, deslocaram o comprimento de onda máximo (λmax) para valores maiores, devido ao processo de dissociação, que expôs o centro di-cobre da hemoproteína (cobre é supressor de fluorescência), além de favorecer a exposição do Triptofano ao solvente. Os resultados de LSI da HcMac mostram que em pH 5,0 houve uma forte interação entre proteína-SDS em concentrações inferiores a 1,0 mmo.L-1, pois a LSI aumentou em 12 vezes sua intensidade em relação HcMac pura em solução. A HcMac nativa apresentou atividade PO induzida pelo surfactante SDS e não demonstrou ação antimicrobiana nos testes realizados. Os resultados obtidos até o momento são relevantes, pois trazem informações importantes para avançarmos nos estudos de caracterização e aplicação biotecnológica da HcMac.
Imobilização de xilanases de Aspergillus labruscus ITAL 22.223: utilização em reator para obtenção de xilose a partir de sabugo de milho para produção de xilitol
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-09-02) Maestrello, Chadia Chahud ; Guimarães, Luis Henrique Souza ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O sabugo de milho é um resíduo rico em material lignocelulósico que pode ser reaproveitado para produção de xilitol, por meio de conversão enzimática e posterior fermentação com leveduras do gênero Candida. Diante do exposto, esse estudo teve por objetivo a extração de xilana de sabugo de milho para ser hidrolisada por xilanase de Aspergillus labruscus ITAL 22.223 imobilizada e a xilose, obtida da hidrólise enzimática, utilizada em fermentação com Candida tropicalis ATCC 750 para produção de xilitol. As xilanas extraídas apresentaram baixa contaminação por proteínas (<0,45%) e fenóis (<0,1%) e quando hidrolisadas enzimáticamente, foi possível constatar, através do CCD, bandas de nítidas de xilose, xilobiose e xilotriose. Na caracterização da atividade enzimática, utilizando xilana comercial como substrato, a enzima apresentou temperatura ótima na faixa de 55–75 ºC, pH ótimo de reação de 4,5 e 5,5, termoestabilidade em 45 ºC por 120 min e estabilidade ao pH na faixa de 3,0 a 5,0 por 1 h. Para xilana extraída de sabugo de milho (ABST) 5% utilizada como substrato, a temperatura ótima de reação para a enzima foi de 45-60 ºC, pH ótimo de reação 3,5 e 5,0, termoestabilidade de 45-50 ºC por 24 h e estabilidade ao pH de 80% de atividade em todas as faixas analisadas. Na imobilização da xilanase, utilizando resinas de troca iônica, obteve-se rendimento, eficiência, atividade recuperada e atividade do derivado de 93%, 97%, 100% e 11U/g, respectivamente, para DEAE-Celulose, e de 99%, 98%, 11% e 8,9 U/g, respectivamente, para DEAE-Sephadex. Os derivados apresentaram temperatura e pH ótimo de reação de 55 ºC e 5,0, utilizando a xilana ABST como substrato. O derivado DEAE-Celulose foi utilizado em reator enzimático para hidrolisar a xilana ABST, obtendo 2mg/mL de xilose ao final de 48 h. Na fermentação com C. tropicalis, a xilose comercial 2% foi 85% consumida a 35 ºC em 72 h de fermentação. No ensaio com a xilose obtida da hidrolise da xilana ABST, a levedura consumiu cerca 60% ao final de 96 h e as análises de HPLC indicaram a produção de 1,02 mg/mL de xilitol em 48 h de fermentação. Deste modo, foi possível produzir xilitol a partir da xilose obtida da hidrólise da xilana de sabugo de milho, potencializando a reutilização do sabugo de milho para produção de produtos de alto valor agregado.
Co-digestão de glicerol bruto e esgoto sanitário visando produção de biogás em reatores anaeróbios horizontais de leito fixo
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-19) Adames, Luan Vieira ; Maintinguer, Sandra Imaculada ; Pires, Lorena Oliveira ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O aumento da demanda de energia e a diminuição da disponibilidade de combustíveis fósseis, juntamente com as crescentes preocupações com questões ambientais, impulsionaram a produção de biocombustíveis, como biodiesel e biogás. A viabilidade econômica da produção de biodiesel exige a valorização do glicerol bruto (GB), seu principal subproduto. A conversão anaeróbia do glicerol residual da produção de biodiesel tem se mostrado uma excelente opção para a produção de energia limpa a baixo custo. Devido a contaminantes presentes no GB, como metanol e sabões, e sua quantidade de matéria orgânica elevada, a co-digestão com outros resíduos é uma estratégia adotada para amenizar seu impacto na microbiota responsável pela digestão anaeróbia. Sendo constituído majoritariamente por água, o esgoto sanitário (ES) é uma excelente opção para diluir os efeitos tóxicos do GB. Neste sentido, o objetivo do presente estudo foi avaliar o emprego de diferentes proporções (v v-1) de GB e ES em quatro reatores anaeróbios horizontais de leito fixo (RAHLF) instalados em série (R1, R2, R3 e R4), em 4 ensaios distintos; 1 (1% GB), 2 (1,5% GB), 3 (2% GB) e 4 (3% GB), referente a: (i) partida do sistema e estabilidade dos reatores; (ii) melhor relação na proporção glicerol bruto e esgoto sanitário para melhoria da produção de biogás (H2 e CH4); (iii) remoção da matéria orgânica; (iv) geração de produtos de valor agregado (ácidos graxos voláteis e 1,3-Propanodiol); (v) identificação das alterações no consórcio microbiano utilizado como inóculo. O aumento do tempo de detenção hidráulica (TDH) de 0,5 para 1 dia (R1), 2,1 para 4,2 dias (R2) e 4,02 para 8,04 dias (R3) resultou em melhores produções de hidrogênio no reator R1 e metano nos reatores R2 e R3. O aumento da proporção de GB resultou em carga orgânicas volumétricas (COV) de 13,05, 18,06, 26,75 e 37,85 g DQO (L d)-1, para os ensaios 1 (1% GB), 2 (1,5% GB), 3 (2% GB) e 4 (3% GB), respectivamente. A produção de hidrogênio mais elevada no reator R1 (277,88 L H2 (m3 d)-1) ocorreu durante o ensaio 2 e no reator R2 durante o ensaio 3 (84,43 L H2 m3 d-1). A maior produção de metano foi de 312,0 L CH4 (m3 d-1) e ocorreu no reator R3 durante o ensaio 1. Nos ensaios 1 e 2 o sistema com três reatores obteve uma média de remoção de DQO de 93,6% e 98,2%, respectivamente. Após o aumento de GB para 2% no ensaio 3 a adição do reator R4 possibilitou o sistema manter uma média de remoção de 97,0% e no ensaio 4 com 3% de GB a média de remoção de DQO foi de 97,5%. Houve geração de 1,3-Propanodiol de até 4,1 g L-1 (R1 – 3% GB) e 4,8 g L-1 (R2 – 3% GB). A estratégia de co-digestão do glicerol bruto e esgoto sanitário evitou a inibição da microbiota. Além disso, houve uma mudança na abundância relativa de microrganismos entre R1, R2 e R3 e uma diminuição considerável no índice de diversidade no reator fermentativo (R1). A ordem Selenomonadales foi favorecida nos reatores R1 e R3 com o aumento do GB. A inibição das arqueias foi verificada nos reatores em série resultando na seleção da ordem Methanosarcinales. Os resultados mostraram o potencial da aplicação de reatores RAHLF em série para recuperação energética, geração de produtos de valor agregado e disposição alternativa do glicerol bruto.
Síntese de peptídeos derivados do domínio funcional da Histatina 5 e sua incorporação em lipossomas como estratégia para inibição de Candida albicans
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-01) Zambom, Carolina Reis ; Garrido, Saulo Santesso ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Candida albicans é o principal micro-organismo causador de infecções na cavidade bucal e já apresenta resistência aos principais antifúngicos utilizados para tratamento. Os peptídeos da família das Histatinas são moléculas promissoras para esse tratamento, devido a sua forte ação contra C. albicans. Histatina-5 (Hst5), um dos peptídeos dessa família, apresenta ação contra esse micro-organismo, mas sofre rápida degradação em saliva humana. Nesse trabalho foram propostas três novas sequências de peptídeos baseados na Hst5, denominados 8WH5, 7WH5 e 6WH5, e os peptídeos análogos 0WHst5, WP113. Além disso, foram desenvolvidos lipossomas produzidos pela técnica de hidratação do filme lipídico, com objetivo de proteger os peptídeos da degradação salivar. Os peptídeos 0WHst5 e WP113 apresentaram degradação após 1,5 horas em saliva humana. Já os peptídeos 8WH5, 7WH5 e 6WH5 foram encontrados na saliva após 8 horas de incubação. Todos os peptídeos apresentaram ação antifúngica, com destaque para o peptídeo 8WH5 que apresentou concentração inibitória mínima (CIM) de 20 µmol L-1 para C. albicans ATCC 90028. Os peptídeos foram eficazes em prevenir a formação de biofilme de C. albicans, mantendo seu crescimento abaixo de 20% em concentrações de 320 e 160 µmol L-1. Os lipossomas vazios apresentaram diâmetro hidrodinâmico médio de 80,0 nm e os lipossomas incorporados com os peptídeos apresentaram aumento nesse diâmetro com valores na faixa de 90,0 a 120,0 nm. O potencial zeta das formulações foi negativo, com valores de -11,6 mV para os lipossomas vazios e valores abaixo de -8,7 mV para os lipossomas incorporados com os peptídeos. O índice de polidispersão ficou entre 0,200 e 0,300 para todos os sistemas lipossomais. A eficiência de incorporação (IPD) foi maior de 90% para todos os peptídeos, indicando uma alta incorporação mesmo se tratando de moléculas hidrofílicas. Estudos de microscopia de força atômica (AFM) e de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) indicaram que os peptídeos podem interagir eletrostaticamente com bicamada externa dos lipossomas. Os lipossomas foram mais eficazes do que os peptídeos livres para inibição de biofilmes maduros inibindo seu crescimento com concentração oito vezes menor do que os peptídeos livres. Dessa forma, é possível concluir que os peptídeos 8WH5, 7WH5 e 6WH5 são mais resistentes a degradação por proteases salivares e foram eficazes em prevenir a formação de biofilme. Já os sistemas lipossomais, apesar de apresentaram proteção reduzida contra degradação proteolítica dos peptídeos, foram eficazes em inibir biofilmes maduros. Dessa forma, os peptídeos e sistemas lipossomais produzidos nesse trabalho surgem como uma nova estratégia para prevenção de infecções causadas por C. albicans na cavidade bucal.
Estudos moleculares e caracterização biofísica da hemoglobina de Amynthas gracilis (HbAg)
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-06-24) Sebastião, Isis ; Santiago, Patricia Soares ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Espécies de minhocas são comumente utilizadas em pesquisas de ecotoxicologia por possuírem características que auxiliam na identificação de poluentes no meio ambiente. Com o avanço da biologia molecular foi possível rastrear proteínas que podem ser utilizadas como marcadores de contaminação ambiental, é o caso da Hemoglobina extraída da espécie de Amynthas gracilis (HbAg). Conhecida como Hb extracelular gigante, a HbAg é um complexo proteico com massa molecular em torno de 3,6 MDa, com capacidade elevada de carreamento de moléculas de O2, estabilidade térmica e resistência ao estresse oxidativo. Todas essas propriedades fazem com que essas Hbs sejam alvo de pesquisas dentro da área de biotecnologia. O objetivo deste trabalho foi anotar o transcriptoma de A. gracilis, permitindo dessa forma, identificar sequências de proteínas com potencial biotecnológico, assim como as sequências codificadoras para a cadeias que compõem a HbAg. Além disso, foi realizado um estudo inicial de caracterização de uma das cadeias dessa hemoproteína, o monômero-d. A montagem do transcriptoma foi realizada utilizando estratégia de novo com o programa Trinity e a anotação funcional foi realizada com o programa OmicsBox que inclui a ferramenta do Blast2GO. As sequências das cadeias de HbAg foram identificadas através da análise de BLAST contra o banco de dados UniprotKB. O modelo para a unidade biológica HbAg foi construído por modelagem comparativa com auxílio do SWISS-model e os esquemas foram desenhados com o programa PyMOL. A caracterização inicial do monômero-d de HbAg foi feita através das técnicas de espectroscopia: absorção UV-Vis e fluorescência, além da técnica de espalhamento de luz (LSI) variando as condições experimentais em função do pH e interação com o surfactante SDS. Foram identificadas 260.616 ORFs das quais 187.866 sequências foram não redundantes e, a partir destas foram anotadas 92.939 sequências de proteínas. Proteínas com potencial biotecnológico assim como classes de enzimas envolvidas no processo de vermicompostagem foram identificadas. Todas as sequências das cadeias de HbAg foram preditas e partir delas construímos um modelo comparativo com base na estrutura de HbGp, Hb homóloga a HbAg. Todos os domínios proteicos mantiveram-se conservados em HbAg. Para o conjunto de dados do monômero-d em função do pH, notou-se auto-oxidação do grupo Heme em pH 9, aumento da intensidade de fluorescência em pH mais básico e possível auto agregação no pH mais ácido (5,0) e pH mais básico (9,0). Já para a interação com o SDS, notamos uma oxidação mais pronunciada a partir da concentração de 4 mmol L-1. O aumento gradativo da intensidade de fluorescência foi observado a partir da concentração de 1,2 mmol L-1 de surfactante. Os dados de LSI levantam a hipótese da formação de agregados entre o monômero-d e o surfactante assim como a presença de auto agregados de monômero em solução. Os dados apresentados neste trabalho trazem conhecimento básico acerca do potencial de A. gracilis no campo da biotecnologia e poderão fomentar pesquisas futuras nas áreas de genômica, com enfoque para o desenvolvimento e caracterização de biomarcadores moleculares na investigação de contaminação ambiental.
Estudo do crescimento e controle de biomassa na produção de biohidrogênio a partir da fermentação escura de vinhaça de cana-de-açúcar usando reatores contínuos de tubos múltiplos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-05-27) Grangeiro, Luana Cardoso ; Medina, Kelly Johana Dussán ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Estudos mostram que a perda de desempenho em sistemas fermentativos após 20 dias de operação pode estar associada ao crescimento inadequado de microrganismos, resultando em excesso ou falta de biomassa nos reatores. O parâmetro que permite medir a relação alimento/microrganismo e consequentemente controlar a biomassa nos reatores é chamado de carga orgânica volumétrica específica (COVe). Desta forma, desenvolver um projeto de reator que permita o controle adequado da COVe pode ser um fator chave na produção de biohidrogênio (BioH2) a longo prazo. Neste contexto, os reatores contínuos de tubos múltiplos (RCTMs) tem se destacado como uma tecnologia promissora devido à sua estrutura fornecer uma região de tubos para fixação da biomassa microbiana, sem utilização de material suporte e ainda permitir a manutenção da COVe, por meio do descarte contínuo da biomassa. Nesta sequência, o objetivo desta pesquisa foi estudar RCTMs com 10 (RCTM10) e 18 (RCTM18) tubos no controle de processo em função da COVe. Na primeira etapa, o RCTM18 foi operado sob condição mesofílica de temperatura (25°C), inoculado por processo de autofermentação e alimentado com água residuária sintética, à base de sacarose como fonte de carbono. Os resultados mostraram que o RCTM18 apresentou o controle adequado de COVe (3,3 – 6,33 gDQOg-1SSV d-1), porém apresentou baixo rendimento médio de hidrogênio (0,043 ± 0,006 molH2.molCH-1), com uma produção volumétrica máxima igual a 415,1 ± 422,1 mLH2 L-1d-1, em faixa de operação de pH 4-5,5. Na segunda etapa, os RCTMs sob condições termofílicas de temperatura (55°C) foram inoculados por processo de autofermentação e alimentados com vinhaça de cana-de-açúcar, como fonte de carbono. O RCTM18 apresentou o melhor resultado no controle da COVe (2,0 - 8,0 gDQO.g-1SSV.d-1) em comparação com o RCTM10 (0,5 – 4,0 gDQO g-1SSV d-1), e semelhante a faixa ótima (2,0 - 7,0 gDQO.g-1SSV.d-1) encontrada na literatura. O RCTM18 (0,0006 ± 0,014 molH2.gDDQO-1) e o RCTM10 (0,0013 ± 0,003 molH2.gDQO-1) apresentaram rendimentos médios de hidrogênio quase nulos. Na terceira etapa, as biomassas acidogênicas dos RCTMs obtidas na operação contínua foram testadas em reatores em modo batelada, as quais produziram hidrogênio e ácidos orgânicos. A quarta e última etapa consistiu no estudo de biologia molecular para a quantificação de metabólitos e caracterização da microbiota, o qual apresentou valores de abundância relativa ao gênero Clostridium sensu stricto 7 (19,87%) no RCTM10 e Bacillus (18,32%) no RCTM18. Isto permitiu a discussão e fundamentação dos resultados desta pesquisa, verificando que os RCTMs se mostraram configurações com potencial para o controle da COVe em meio sintético e vinhaça de cana-de-açúcar, sem a necessidade de descarte de biomassa ou material suporte para adesão dos microrganismos.
Identificação e caracterização de derivados furoxanos e seus mecanismos de ação para o tratamento oral da leishmaniose visceral e malária: uma contribuição para a agenda 2030-UNESP dentro dos objetivos de desenvolvimento sustentável da Organização das Nações Unidas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-06-15) Clementino, Leandro da Costa ; Graminha, Márcia Aparecida Silva ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As doenças negligenciadas representam um grande desafio para políticas em saúde pública, sendo as leishmanioses e a malária duas importantes doenças parasitárias, por acometerem um mesmo perfil populacional e necessitarem de novos agentes terapêuticos para somarem ao portfólio de quimioterápicos atualmente em uso. Considerando os objetivos de Desenvolvimento Sustentável proposto pela ONU, o qual estabelece uma agenda global que propicie o desenvolvimento sustentável como uma perspectiva de construção de um futuro comum, pautado nas Pessoas, Prosperidade, Planeta, Paz e Parcerias. Dentro deste contexto, nosso grupo de pesquisa vem estudando novas moléculas promissoras para o tratamento de doenças parasitárias, contribuindo para o tema Saúde e Bem-Estar que visa o desenvolvimento de pesquisas direcionadas ao entendimento e ações de prevenção, terapia e controle de doenças transmissíveis e não transmissíveis, desenvolvimento e avaliação de novos fármacos e medicamentos. Assim, ao longo do desenvolvimento desta pesquisa, furoxanos (4a-o) e benzofuroxanos (4p-x) foram caracterizados quanto ao potencial anti-amastigota para Leishmania infantum, identificando os furoxanos doadores de NO (4a-h, 4l-m) e o benzofuroxano 4r como os mais potentes (EC50 < 10 μM) e seletivos (SI > 10). Após clonagem do gene e expressão da correspondente enzima cisteíno protease de Leishmania mexicana LmCPB2.8ΔCTE (CPB 2.8) em Pichia pastoris, verificou-se que os furoxanos (4a-n), benzofuroxanos (4q-r e 4t-u) e N-acil-hidrazonas (14a-g) apresentam boa capacidade de inibir a protease parasitária (0,8 < IC50 < 14 μM). Como prova de conceito, destaca-se que a atividade leishmanicida dos compostos pode estar relacionada a um efeito dual provocado pela atividade microbicida do NO, associada à inibição da enzima, visto que (14a-g) inibem CPB2.8 (2 < IC50 < 12 μM), mas não apresentam atividade anti-amastigota na máxima concentração testada (10 μM). A análise in silico de parâmetros farmacocinéticos indicou 4f para avaliação quanto ao seu potencial terapêutico frente a camundongos Balb/c infectados com L. infantum. Verificou-se que a administração oral duas vezes ao dia com uma dose de 7.7 mg/kg/dia, foi capaz de reduzir em 90% a carga parasitária no fígado e baço, sem causar danos hepáticos ou renais, finalizando assim o trabalho desenvolvido para L. infantum. Todas as moléculas foram posteriormente avaliadas frente a formas intra-eritrocitárias de Plasmodium falciparum geneticamente modificados para expressar o indicador de Ca2+ GCaMP3, mediante estágio sanduíche na New Jersey Medical School, Rutgers, Newark – EUA. Dentre os furoxanos, 4m (EC50 2,8 μM) foi o mais promissor, enquanto 4r foi o benzofuroxano mais ativo, apresentando inibição em torno de 40% do crescimento parasitário. Estudos de mecanismos de ação mostraram que 4m não é capaz de alterar a morfologia do vacúolo digestivo, onde está localizada a cisteíno protease de plasmódio, como pode ser observado para o controle inibidor de proteases E64. Análise do extrato proteico de eritrócitos infectados e tratados por 10 horas com 4m ou E64 mostrou acúmulo de proteínas não degradadas apenas no tratamento com E64, indicando que a cisteíno protease de P. falciparum, potencialmente, não é o alvo de 4m. Foi analisada também a capacidade dos compostos interferir na homeostase do Ca2+ intracelular, sendo 4m capaz de alterar os níveis deste íon no parasita, não apresentando o mesmo efeito em hepatócitos murinos, após liberação do cátion a partir do retículo endoplasmático, sendo, portanto, este efeito seletivo para o parasita. A influência do NO liberado pela molécula 4m neste desbalanço foi descartada, visto que o composto doador de NO utilizado como controle não promoveu nenhuma alteração nos níveis de cálcio. Estes dados mostram que os furoxanos possuem grande potencial para o desenvolvimento de anti-leishmaniais e anti-maláricos.
Avaliação da capacidade de peptídeos oriundos da hidrólise da proteína β-vignina na modulação do metabolismo lipídico
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-06-06) Silva, Mariana Barros de Cerqueira e ; Cilli, Eduardo Maffud ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As doenças cardiovasculares (DCV) são a maior causa de mortalidade no mundo. Entre os processos dislipidêmicos, a hipercolesterolemia é o principal fator de risco para o desenvolvimento dessas doenças. As estatinas são o tratamento de primeira escolha, e embora sejam bem toleradas, apresentam diversos efeitos adversos. Por outro lado, peptídeos derivados de algumas proteínas, especialmente àquelas encontradas nos grãos de leguminosas têm mostrado exercer efeito redutor da concentração de colesterol plasmático. Em estudos anteriores, peptídeos derivados da proteína β-vignina do feijão-caupí diminuiram a atividade da enzima HMG-CoA redutase, in vitro. Nesse trabalho avaliamos a capacidade dos peptídeos MPNY, QDF e GSTLN e seus análogos e conjugados em regular o metabolismo lipídico in sílico e in vitro. Os peptídeos MPNY e QDF também foram avaliados em ratos alimentados com dieta hiperlipídica. Os peptídeos foram sintetizados, utilizando o método de síntese em fase sólida e purificados por FR-CLAE. A atividade de inibição enzimática foi avaliada em ensaios in vitro, utilizando kit HMG-CoA reductase assay. No estudo in vivo, os peptídeos e a sinvastatina foram administrados por via oral (10 mg/kg de peso) em ratos e os efeitos foram avaliados após 14 dias. A ingestão alimentar foi semelhante entre todos os grupos, com exceção ao grupo tratado com sinvastatina, que apresentou menor consumo e ganho de peso (16%). Não houve diferença significativa entre os grupos em relação ao HDL-C, contudo o grupo tratado com QDF apresentou menor concentração de triglicérides (-23%) comparado com o grupo controle sem tratamento, não havendo diferença na concentração de colesterol total. O grupo tratado com sinvastatina, comparado ao grupo controle, mostrou redução das concentrações de colesterol total (-21%) e triglicérides (-23%), mas apresentou aumento significativo (+27%) da concentração de glicose. Os dados ainda mostraram uma maior toxicidade da sinvastatina em relação aos dois peptídeos em linhagens tumorais HepG2 (hepatocarcinoma humano), Caco2 (carcinoma de cólon) e A204 (rabdomiossarcoma). Adicionalmente, análogos do QDF desenhados durante o projeto sozinhos e ligados covalentemente ao GSTLN demonstraram capacidade em inibir a HMG-CoA redutase in sílico e in vitro. Os peptídeos NDY, pGluDF e pGluDFespaçador1-GSTLN apresentaram IC50 de 112,4, 95,50 e 54,96 µM respectivamente. O pGluDF-espaçador1-GSTLN, que mostrou maior potência, sendo aparentemente capaz de inibir a enzima nos sítios catalíticos de ligação do substrato e no de ligação do NADPH. Os resultados demonstraram que peptídeos oriundos de leguminosas apresentam potencial hipocolesterolêmico e podem ser considerados novos compostos no desenvolvimento de moléculas com atividade hipocolesterolêmica e utilizado no tratamento das doenças cardiovasculares.

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