Instituto de Biociências, Botucatu

URI Permanente para esta coleçãohttps://hdl.handle.net/11449/151808

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Papel da sinalização TGF-β no nicho espermatogonial de zebrafish
(Universidade Estadual Paulista (UNESP), 2018-12-20) Costa, Daniel Fernandes da ; Nóbrega, Rafael Henrique ; Universidade Estadual Paulista (UNESP)
A via de sinalização TGF-β está presente em todos os metazoários, regulando diversas etapas do desenvolvimento embrionário e da resposta imunológica, além de estar envolvida no processo carcinogênico e regulação da espermatogênese. A espermatogênese é um processo altamente organizado, cujo funcionamento adequado garante a sobrevivência das espécies. Maiores estudos que auxiliem na compreensão dos mecanismos endócrinos e parácrinos responsáveis pelo refinamento dos processos que ocorrem no nicho espermatogonial são necessários. Visto isso, a via de TGF-β por mediar processos celulares fundamentais para a função testicular (auto-renovação e diferenciação), se torna de grande relevância para uma compreensão mais ampla do processo espermatogênico. Uma abordagem muito valiosa para o entendimento da função testicular é a utilização de inibidores específicos de vias de sinalização. Dito isso, com o intuito de avaliar o papel da subfamília TGF-β no nicho espermatogonial de zebrafish, foi utilizado o inibidor A83-01, bloqueador da ativação da subfamília TGF- β (TGF-β, Inibina, Actina e Nodal). Também, foi avaliado o papel do Fsh na via de sinalização TGF-β, de forma a agregar aspectos importantes sobre essa sinalização e sua influência no nicho espermatogonial de teleósteos. Nossos resultados mostram que o inibidor potencializou os efeitos de pró-diferenciação do Fsh, favorecendo diferenciação excessiva e reduzindo os estoques de espermatogônias tronco. Desta forma, conclui-se que os resultados aqui encontrados indicam que a subfamília TGF-β atua como fator pró-proliferação, promovendo auto-renovação espermatogonial.
Mapeando a diversidade genética do complexo Pythium insidiosum
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-04-26) Prado, Ana Carolina do ; Chechi, Jéssica Luana
Pythium insidiosum é agente etiológico da pitiose, uma doença com prevalência em regiões de climas tropical e subtropical que acomete diferentes espécies animais, inclusive humanos. Estudos filogenéticos têm mostrado divergências intraespecíficas, primeiramente ao evidenciar que a espécie era dividida em três clados monofiléticos de acordo com diferentes regiões geográficas e, recentemente, por um dos clados ter sido classificado como uma nova espécie, Pythium periculosum. No entanto, essas informações foram baseadas em análises filogenéticas empregando-se de poucos genes isolados. Além disso, as relações entre os clados, bem como a inclusão de cepas brasileiras na caracterização a nível genômico em P. insidiosum são limitadas. Dessa forma, visamos traçar a relação genética de isolados de Pythium insidiosum de diferentes regiões do globo, por meio de inferências filogenéticas e de caracterização genotípica. No primeiro capítulo exploramos as inferências filogenéticas utilizando regiões gênicas codificantes da α e β-tubulina, do fator de alongamento da tradução (Tef-1α), da subunidade II do citocromo oxidase (COX II) e a região do rDNA, o espaçador interno transcrito (ITS) 5.8S. Foram utilizadas matrizes contendo 55 taxons, de isolados de diversos países e dois grupos externos. As matrizes foram submetidas às inferências Máxima Verossimilhança, Baysena e Máxima Parcimônia. Para as análises genotípicas submetemos genomas representantes dos três clados intraespecífico (n=12), disponíveis na base de dados GenBank à técnica AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) in silico. Nossos resultados filogenéticos mostram que, para todos os genes avaliados, houve maior proximidade evolutiva do clado I e II, e que esses se distanciam acentuadamente do clado III. Os genes da α e β-tubulina e COXII demostram diversidade genética dentro de cada clado sendo interessante para estudos evolutivos. Já Tef-1α separa os isolados em dois clados, sendo um dos clados politômicos (clado I e II) e outro contendo cepas do clado III, considerada atualmente uma nova espécie e, dessa forma, esse gene pode ser usado na diferenciação entre P. insidiosum e P. periculosum. A genotipagem explicita a proximidade entre os clado I e II, no entanto mostra cepas incluídas anteriormente no clado I alocadas ao clado III, considerada nova espécie críptica, esses resultados são corroborados na análise filogenética, explicitando a necessidade de validação contínua das técnicas de genotipagem com os antigos e novos isolados em comparação com análises evolutivas propriamente dita, para melhor entendimento da epidemiologia e disseminação da espécie a nível mundial.
Impactos da restrição alimentar em diferentes fases da ontogenia na memória e hipocampo de ratos de meia idade
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-02-28) Lawi, Youssef Said Abu ; Horta Júnior, José de Anchieta de Castro e
A memória consiste em componente cognitivo expresso após aquisição, retenção, armazenamento e evocação de informações aprendidas. Parte deste processo é dependente, em sua formação e consolidação, do hipocampo. Esta estrutura é particularmente sensível aos mais diversos fatores ambientais, como a dieta. Pela literatura, a restrição alimentar nos períodos de gestação e lactação é importante indutor de programação fetal e pode ocasionar déficits na memória espacial, bem como reduzir a proliferação e ativação celular no hipocampo, o que pode impactar processos cognitivos em estágios futuros da vida, ao passo que a restrição alimentar na fase adulta promove efeitos opostos. Diversos estudos foram feitos com estes diferentes enfoques, todavia, são desconhecidos os efeitos da combinação da restrição alimentar em diferentes momentos da vida sobre a memória, proliferação celular, plasticidade e ativação neuronal no hipocampo. O objetivo deste trabalho consiste em analisar a memória espacial, citoarquitetura, neurogênese e imunorreatividade à proteína FOS no hipocampo de ratos Wistar submetidos à programação por restrição alimentar na fase fetal e perinatal combinada à restrição alimentar na fase adulta. Para sua execução, ratas Wistar prenhas foram separadas em dois grupos experimentais: grupo programação controle (PC), dieta normal, ad libitum; e grupo programação por restrição alimentar (PR), dieta de 50% de restrição em relação ao grupo controle nos períodos de prenhez e lactação. Ambos os grupos foram subdivididos em outros dois grupos, desta vez para restrição alimentar aplicada na fase adulta: o grupo alimentação controle (AC), dieta normal, ad libitum; e o grupo alimentação restrita (AR), dieta com redução de 30% em relação ao controle dos 60 aos 100 dias de idade e dos 270 aos 385 dias de idade (155 dias no total). Assim, foram estudados 4 grupos experimentais: PC-AC, PC-AR, PR-AC e PR-AR. A memória espacial e plasticidade neuronal dos animais foram avaliadas pelo Labirinto de Barnes, por meio de protocolo de recuperação e extinção de memória (memory retrieval and extinction) e novo aprendizado (reversal learning). Após o teste comportamental, os animais foram perfundidos e tiveram os encéfalos coletados. No dia da eutanásia foram aferidos parâmetros biométricos de peso corporal, peso do encéfalo, distância naso-anal, gorduras (visceral, periepididimal e retroperitoneal) e coletados os pelos dos animais. Os encéfalos passaram por protocolo de imuno-histoquímica para FOS e Doublecortina. As análises identificaram que a programação e dieta de fase adulta por restrição alimentar tiveram impacto significativo nos dados biométricos dos animais, visto que houve redução do peso, distância naso-anal e gorduras, nos quais o grupo PR-AR apresentou os menores valores, enquanto o grupo PC-AC registrou os maiores. A programação promoveu redução do peso e índice encefálico, e a restrição de fase adulta foi determinante para redução do tecido adiposo, pois os grupos submetidos a este protocolo apresentaram valores menores do índice de adiposidade. No Labirinto de Barnes foi verificado que os animais compreendem o contexto de execução de tarefa do labirinto após vários meses desde a última exposição, houve condição para aprendizado da nova localização da caixa de escape, porém não foram identificadas diferenças entre os grupos nos parâmetros avaliados. Foi detectado efeito de programação e maior quantidade de células imunorreativas à proteína FOS na região do giro denteado nos animais dos grupos programados (PR-AC e PR-AR), embora as diferenças não tenham sido significantes. Tampouco houve diferenças significativas na imunorreatividade à FOS no hipocampo inteiro e nas regiões CA1 e CA3, separadamente. Em relação à neurogênese por imunorreatividade à doublecortina, os animais do grupo PR-AC apresentam maior quantidade de células precursoras no giro denteado superior, porém não foram observadas diferenças nos grupos estudados ao considerar toda a região do giro denteado. Concluiu-se que a restrição alimentar em diferentes fases da vida promove alterações biométricas relevantes, modifica padrões de ativação neuronal, entretanto não representa amplas alterações funcionais de memória espacial.
Efeitos das ondas de calor marinhas sobre o comportamento e fisiologia de presas-predadores estuarinos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-03-01) Borges, Dalila Junqueira ; Costa, Tânia Marcia ; Marochi, Murilo Zanetti
As mudanças climáticas globais impactam ecossistemas costeiros. Ondas de calor marinhas (MHW) podem ser acompanhadas de consequências negativas aos organismos, como alterações no comportamento alimentar e no uso de energia. Os invertebrados estuarinos estão sujeitos aos efeitos do aquecimento das águas, causando mudanças fisiológicas devido ao estresse térmico, refletindo em suas interações ecológicas, incluindo as dinâmicas entre presa e predador, à medida que as ondas de calor tornam-se mais frequentes e intensas. Este estudo investigou como esses eventos afetam a relação entre a ostra Crassostrea brasiliana e seu predador, o caranguejo Panopeus austrobesus. Para tal, foi realizado um experimento laboratorial que simulou MHW (31,2°C) em relação ao tratamento controle (27,3°C), tendo como variáveis respostas a latência, a taxa de alimentação do predador e a relação glicose na hemolinfa - glicogênio no hepatopâncreas, bem como as taxas de lactato na hemolinfa do predador. Machos e fêmeas do predador foram utilizados nos expeirmentos. Notamos que apenas em fêmeas o cenário de ondas de calor marinha reduziu a latência para o predador capturar a presa. A taxa de alimentação do predador não apresentou efeitos entre os tratamentos analisados em ambos sexos. Em fêmeas, dentre as análises fisiológicas realizadas, apenas a taxa de concentração de glicogênio estocada no hepatopâncreas foi menor em cenários de aquecimento, e os machos não apresentaram efeitos em nenhum parâmetro. Nossos resultados apontam que as ondas de calor não aumentam o consumo da presa pelo predador, mas que em fêmeas reduz o tempo de reação, levando os caranguejos a capturar a presa mais rapidamente, podendo ser associado a um menor estoque de glicogênio.
Potencial da zircônia na modulação de células endoteliais e osteoblastos: perspectivas para engenharia de tecidos e regeneração óssea
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-28) Camargo, Beatriz de Almeida ; Zambuzzi, Willian Fernando ; Unesp
A osteogênese desempenha um papel crucial na restauração do tecido ósseo, e biomateriais são frequentemente empregados para facilitar essa reparação. A interação inicial entre células endoteliais e biomateriais é essencial para a formação de tecido angiogênico, nutrição adequada e restauração tecidual. No entanto, nosso entendimento dessa interação ainda é limitado. Este estudo visa avaliar os efeitos do meio de cultura enriquecido com zircônia (Zr) no metabolismo das células endoteliais HUVEC, investigando múltiplas vias moleculares. A zircônia foi condicionada em meio de cultura por 24 horas, suplementada com soro fetal bovino, e posteriormente utilizada no tratamento das células endoteliais. O estudo foi realizado sob duas condições distintas: aplicando estresse de cisalhamento e em estado estático. Após 72 horas, amostras foram coletadas para análises estatísticas, Western Blotting, Zimografia e RT-qPCR. A interação célula-biomaterial demonstrou redução na expressão do gene Src e aumento na expressão de genes relacionados à transição de fases do ciclo celular e regulação da proliferação, como o gene p15, nas células tratadas com ZrO2, independentemente da presença de estresse de cisalhamento. Houve também aumento nas concentrações de CDK2 e CDK4 nos grupos expostos ao ZrO2. Observou-se possível reorganização do citoesqueleto, indicada pela regulação positiva da Cofilina em ambos os grupos, embora sua concentração proteica tenha diminuído sob estresse de cisalhamento. A via do TGF β, que regula a expressão de MAP-quinases e AKT, apresentou aumento no TGF-β nos grupos tratados com zircônia, sob ambas as condições. Proteínas ERK e JNK foram superexpressas apenas no grupo sob estresse de cisalhamento, enquanto AKT, crucial na regulação da proliferação celular, teve sua expressão aumentada sob condições de ZrO2/Shear-Stress, com redução nos níveis proteicos nos grupos tratados apenas com meio condicionado. Esses resultados destacam respostas adaptativas nas vias de adesão celular, proliferação, sobrevivência, ciclo celular e remodelação da matriz extracelular, contribuindo para a reorganização da matriz óssea através da atividade das matriz metaloproteinases e seus inibidores.
Análise de modelos de programação por metas aplicados no tratamento de câncer de cabeça e pescoço e de próstata
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-28) Castro Júnior, Richard ; Cantane, Daniela Renata
A radioterapia é um tratamento que utiliza radiação ionizante para controlar ou eliminar células cancerosas. O desafio consiste em garantir uma distribuição adequada de dose para eliminar efetivamente as células cancerosas e preservar, ao mesmo tempo, o tecido saudável circundante. O planejamento viabiliza a seleção de grupos de feixes de radiação e o cálculo preciso da dose a ser administrada ao paciente, por exemplo. Para atingir esse objetivo, utilizam-se modelos matemáticos que otimizam o planejamento radioterápico, baseando-se em imagens tomográficas para mapear os tumores, simular a distribuição da dose de radiação e estimar os potenciais efeitos no corpo do paciente. Uma abordagem baseada em metas pode ser eficiente e eficaz na tomada de decisão quando envolve múltiplos critérios. Uma das técnicas aplicadas neste trabalho é a programação por metas estendido, que considera a programação por metas por pesos e de Chebyshev. Neste trabalho, essa modelagem foi aplicada ao planejamento de radioterapia, utilizando dados de casos reais de pacientes diagnosticados com câncer de cabeça e pescoço e com câncer de próstata. Na análise dos desvios indesejáveis para os tratamentos de ambos os cânceres, foi possível determinar a programação por metas ponderadas como a mais apropriada para o planejamento do tratamento. No entanto, ajustes foram necessários em todos os planejamentos de tratamento para câncer de próstata a fim de alcançar os objetivos estabelecidos. Duas estratégias foram adotadas: selecionar α próximo a zero e próximo a um e utilizar pesos diferentes que priorizassem desvios específicos. Entre essas estratégias, a abordagem que prioriza desvios demonstrou ser mais eficaz. Foi proposta a metaheurística Busca em Vizinhança Variável para a seleção do conjunto de feixes em um planejamento de radioterapia. A análise da seleção de feixes para o tratamento de câncer de cabeça e pescoço revelou que o aumento no número de feixes melhora o planejamento, porém o tempo computacional é maior nestes casos. Conclui-se que o modelo investigado demonstrou eficiência nas estratégias de dosagem, permitindo aos médicos e físicos médicos definir o melhor plano de tratamento para cada paciente.
Monogenéticos parasitos de Cyphocharax modestus (Fernández-Yépez, 1948) procedentes do Rio Pardo, Médio Rio Paranapanema, São Paulo
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 0024-02-22) Pereira, Melissa Miyuki Osaki ; Silva, Reinaldo José da ; Ebert, Mariana Bertholdi
A região Neotropical se destaca por abrigar uma vasta diversidade de peixes de água doce, junto com uma ampla variedade de parasitos que desempenham um papel essencial na regulação das populações de hospedeiros e na estruturação das comunidades aquáticas. A classe Monogenea, que compreende parasitos majoritariamente de peixes, é particularmente diversificada na região, com mais de 60 gêneros propostos. Essa biodiversidade pode ser explorada de maneira abrangente, desde inventário de espécies, inferindo relações evolutivas entre hospedeiro e parasito, até aspectos que podem atuar como reguladores de abundância ou densidade das populações de hospedeiros. Portanto, é de suma importância caracterizar e compreender as comunidades de parasitos presentes nos ecossistemas. Neste cenário, dentre os grupos de peixes da região Neotropical, a ordem Characiformes possui grande diversidade de espécies, sendo mais de 1.800 encontrados exclusivamente em ambientes de água doce. Em virtude disso, o objetivo deste trabalho foi inventariar a biodiversidade de monogenéticos parasitos de Cyphocharax modestus coletados entre 2020 a 2023 no Rio Pardo, Médio Rio Paranapanema, São Paulo. Para isso, foram coletados 67 indivíduos da espécie em diferentes pontos, e investigados quanto a sua fauna de parasitos monogenéticos. Com base nos dados morfológicos, foi possível identificar cinco táxons de monogenéticos pertencentes aos gêneros Annulotrematoides (1) e Urocleidoides (4) da família Dactylogyridae, e um táxon pertencente à família Gyrodactylidae. Dessas seis, duas novas espécies de Urocleidoides são apresentadas, suportadas por dados morfológicos e moleculares (28S rDNA e COI mtDNA). Os resultados gerais demonstraram a riqueza de monogenéticos na espécie C. modestus na localidade do presente estudo, contribuindo com a primeira sequência de uma espécie do gênero Annulotrematoides, sequências de Urocleidoides das espécies U. surianoae e U. triangulus, e das duas novas espécies. Além disso, análises filogenéticas contribuíram para o conhecimento da diversidade ainda em processo de evidenciação da região Neotropical de maneira que foi possível verificar a necessidade de revisão dos gêneros Annulotrematoides e Urocleidoides.
Perfil transcricional de células musculares de pacu (Piaractus mesopotamicus) em resposta a sinais pró-crescimento: estudos in vitro e in vivo
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-01-29) Zanella, Bruna Tereza Thomazini ; Pai, Maeli Dal ; Duran, Bruno Oliveira da Silva ; Instituto de Biociências de Botucatu
Os peixes compõem um dos grupos de vertebrados mais diversos do planeta, apresentando importância econômica e ecológica. O estudo da biologia desses animais tem sido aplicado para compreensão de fenômenos biológicos e para a avaliação do controle de poluentes, sendo considerados importantes indicadores biológicos. Dentre outras propriedades, esses animais apresentam características relevantes para o estudo do músculo que os diferenciam de outros grupos, porém o perfil molecular de suas células musculares em ambiente in vitro não é bem caracterizado. A cultura de células tem contribuído para a compreensão dos efeitos diretos de fatores extrínsecos em células musculares, considerando que estes podem desencadear alterações em vias de sinalização no tecido muscular, resultando também na alteração do fenótipo desse tecido. Fatores pró-crescimento tem sido estudados como fortes efetores para o estímulo da miogênese e hipertrofia das células musculares, sendo o Igf1 (insulin-like growth factor 1) um dos fatores mais estudados nesses animais. Nesse sentido, objetivamos caracterizar o perfil transcricional de células musculares in vitro de pacus (Piaractus mesopotamicus), em relação ao tecido muscular esquelético in vivo de juvenis dessa espécie e avaliar o perfil transcricional dessas células frente a exposição aos fatores pró-crescimento, Igf1 e aminoácidos. De forma geral observamos que as principais diferenças moleculares entre os modelos in vitro e in vivo foram relacionadas à proliferação e diferenciação celular, estabelecimento de matriz extracelular e comunicação célula-célula, sendo estes processos mais enriquecidos no modelo in vitro, e processos de obtenção de energia, sendo no modelo in vivo esses processos foram mais diversos. Quanto ao estímulo com os fatores pró-crescimento, observamos que os aminoácidos tiveram um efeito direto e terminal no crescimento muscular, estimulando processos de proliferação e diferenciação das células musculares, enquanto o tratamento com Igf1 teve um efeito inicial e indireto, estimulando a síntese de proteínas e componentes de sua própria via de sinalização. Identificamos genes chaves e microRNAs modulados especificamente por esses fatores pró-crescimento que podem ser utilizados futuramente como possíveis marcadores moleculares da modulação do crescimento muscular. Em conjunto, os dados obtidos no presente estudo podem permitir uma melhor compreensão sobre a manutenção de células musculares de peixes em ambiente in vitro, possibilitando melhor caracterização do perfil molecular do músculo esquelético de peixes e possíveis aplicações na produção de carne in vitro, além de elucidar o mecanismo de ação de fatores de crescimento no tecido muscular desses animais, possibilitando futuras aplicações nos sistemas de aquicultura
Revisão taxonômica das espécies de Calopogonium Desv. na América do Sul e de Teramnus P.Browne ocorrentes no Brasil (Leguminosae, Papilionoideae, Phaseoleae)
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-01-15) Nascimento, Gildean Macedo ; Perez, Ana Paula Fortuna
Calopogonium Desv. e Teramnus P.Browne estão incluídos na subtribo Glycininae, tribo Phaseoleae (Leguminosae), sendo relacionados morfológica e sistematicamente. Muitos caracteres entre os representantes na subtribo se sobrepõem, principalmente àqueles relativos ao cálice, como o formato, pilosidade e número de lacínias; a disposição e formato de suas inflorescências; a simetria foliar e a presença e tipo de indumento nas estruturas reprodutivas e no caule. Estas sobreposições, por sua vez, dificultam as delimitações infra, e até supra genéricas nos grupos, tornando-os, por vezes, pouco discerníveis do ponto de vista taxonômico. Calopogonium é constituído por oito espécies com distribuição nas regiões tropicais e temperadas do globo, destas, cinco ocorrem na América do Sul e quatro no Brasil. Já Teramnus possui cerca de dez espécies com distribuição pantropical e apenas três são mencionadas para a América do Sul, destas, duas para o Brasil. Ambos os gêneros são escassamente estudados do ponto de vista taxonômico e/ou filogenético, praticamente não sendo possível encontrar literaturas que os incluam. O trabalho mais recente encontrado em literatura foi realizado em 1982 por Carvalho-Okano, que tratou as espécies brasileiras de Calopogonium. Diante disso, o presente estudo teve por objetivo realizar a revisão taxonômica dos táxons dos gêneros Calopogonium e Teramnus que possuem ocorrência na América do Sul, a fim de propor melhor discriminação para os respectivos grupos, além de, possivelmente, reconhecer novas espécies, sinônimos e variedades, visando contribuir com a sistemática dos gêneros. Foram feitas descrições de todas as espécies sul-americanas de Calopogonium e das espécies brasileiras Teramnus, com atualizações nomenclaturais, chave de identificação, status de conservação, pranchas ilustrativas e notas sobre a micromorfologia de aspectos do desenvolvimento floral para uma espécie representante de Calopogonium. Como resultado ainda, uma sinonimização, três lectotipificações e uma neotipificação foram propostas. A distribuição geográfica para algumas espécies foi ampliada, enquanto para outras, não se pôde confirmar a sua ocorrência em localidades para onde estavam citadas. O status de conservação para todas as espécies foi realizado conforme critérios da IUCN, classificando três das espécies de Calopogonium e uma das espécies de Teramnus como Pouco Preocupante para risco de extinção; e uma espécie de Calopogonium e outra de Teramnus como Quase Ameaçadas para risco de extinção.
Study of genes stimulated by interferon-τ in immune cells as candidates for pregnancy markers in bovine females
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-08) Feltrin, Isabella Rio ; Membrive, Claudia Maria Bertan ; Pugliesi, Guilherme ; Universidade de São Paulo (Usp)
Nas fêmeas bovinas, as perdas embrionárias ocorridas entre o 14º e o 19º dia após o estro afetam significativamente a eficiência reprodutiva dos rebanhos. Portanto, o desenvol-vimento de métodos diagnósticos capazes de detectar precocemente a gestação ou não gestação é um ponto importante para melhorar o desempenho reprodutivo dos bovinos. O interferon-τ (IFN-τ) produzido pelo concepto desempenha um papel importante du-rante o reconhecimento materno da prenhez (MPR) em ruminantes, que envolve mais do que a inibição dos pulsos luteolíticos da prostaglandina F2 alfa (PGF2α) para manter a funcionalidade do corpo lúteo (CL). Para uma prenhez bem-sucedida, o concepto semi-alogênico deve evitar a sua rejeição pelo sistema imunológico materno, destacando a importância de elucidar os mecanismos envolvidos durante o início da prenhez. Além disso, neste momento, o IFN-τ é liberado na circulação sanguínea e estimula a expressão de genes (ISGs). O estudo da expressão gênica dos ISGs clássicos (ISG15, OAS1, MX1 e MX2) em células imunes do sangue periférico, como células mono (PBMC) e polimor-fonucleares (PMN) já vem sendo utilizado como ferramenta de diagnóstico precoce da prenhez, porém apresentou baixa acurácia. Neste contexto, nossos objetivos neste estudo foram: 1) caracterizar a magnitude da resposta dos ISGs clássicos (ISG15) e não clássi-cos (RSAD2 e IFI44); bem como o perfil das citocinas pró- (IL1β) e anti-inflamatórias (IL10) em PBMC e PMN estimuladas com IFN-τ (Experimento 1) ou lavados uterinos (UF) de vacas gestantes (Experimento 2); e 2) avaliar a acurácia desses biomarcadores recentemente identificados (RSAD2 e IFI44) como preditores da prenhez precoce em fêmeas bovinas (Experimento 3). Nos Experimentos 1 e 2, PBMC e PMN foram isola-das do sangue de vacas Nelore não gestantes (N=9) entre 10-12 dias pós-ovulação (D0 = dia da ovulação), e estimuladas com 100 ng/mL de roIFNT ou UF de vacas no dia 18 de gestação. A expressão gênica foi determinada por qPCR. Para o Experimento 3, fêmeas Nelore (nulíparas, N=103; primíparas, N=53; pluríparas, N=91) foram submetidas à cole-ta de sangue para isolamento das PMN, e foi realizada ultrassonografia Doppler para avaliar a funcionalidade do CL no D20 após inseminação artificial em tempo fixo (D0 = dia da IATF). A expressão gênica também foi determinada por qPCR. Além disso, fo-ram realizadas curvas ROC para determinar a acurácia dos preditores da prenhez no D20 (ISGs e Doppler). Nos Experimentos 1 e 2, a expressão de todos os ISGs foi maior (P<0,05) em ambas as células tratadas com roIFNT e UF-Conceptus do que nos grupos Controle. O fold change indicou que o ISG15 e RSAD2 foram os genes mais estimula-dos (P<0,05) em PBMC e PMN. A expressão de IL1β foi menor (P<0,05) em PBMC e PMN tratadas com UF-Conceptus; no entanto, nenhuma diferença (P>0,1) foi observa-da entre os outros grupos de tratamento. Para o Experimento 3, todas as combinações genéticas foram testadas, e a melhor associação para aumento da acurácia (92,7%) e re-dução de resultados falsos negativos (0,9%, 2/233) foi obtida quando os animais foram considerados prenhes se um dos os quatro ISGs (ISG15, OAS1, RSAD2 e IFI44) foram estimulados em fêmeas com CL ativo (> 25% de perfusão sanguínea) no D20. Conclu-indo, o ISG15 e RSAD2 foram os ISGs mais estimulados em PBMC e PMN, indicando que uma associação entre ISGs clássicos e não clássicos pode ser utilizada como uma ferramenta precoce para melhorar a predição da prenhez no D20 em fêmeas bovinas com CL ativo determinado através da US-Doppler.
Barreira química para a dispersão da ictiofauna: uma análise do rio Tietê e seus tributários
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-26) Urbanski, Bruna Quirici ; Nogueira, Marcos Gomes ; Roxo, Fábio Fernandes
Ao longo do tempo, barreiras artificiais para a dispersão das espécies surgiram como consequência do crescimento populacional e do desenvolvimento econômico da sociedade. No caso dos ambientes aquáticos, sabe-se que diferentes tipos de distúrbios antrópicos podem influenciar nesse processo, sendo a poluição um importante fator modificador da estruturação da biota regional, principalmente da ictiofauna. A bacia do rio Tietê, que possui um longo histórico de degradação ambiental, apresenta, em seu trecho médio, ambientes contrastantes em termos de qualidade de água. Contudo, estes sistemas fluviais estão amplamente interligados, sem quaisquer barreiras físicas naturais ou artificiais que possam interferir na livre circulação dos organismos. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar as limitações que ocorrem no processo de dispersão da fauna de peixes dessa bacia, entre o rio Tietê e seus afluentes diretos (rio Sorocaba, rio Capivari e rio do Peixe), devido à poluição das águas do rio principal. O estudo se baseou em inventários da comunidade íctica por meio de redes de espera, seus atributos ecológicos e na determinação simultânea das variáveis limnológicas no final das estações chuvosa (abril de 2019) e seca (outubro de 2019). Para ambos os períodos de amostragem, a análise de componentes principais (ACP) mostrou uma clara diferença na qualidade da água do rio principal (pior condição) em comparação com os afluentes (melhor condição). Essa diferença também foi evidenciada através do nMDS baseado na composição da ictiofauna dos rios, com a diversidade de espécies muito maior nos tributários (11 a 14 spp.) em relação ao rio Tietê (3 a 4 spp.). A análise do DistLM mostrou que existe uma correlação significativa entre as variáveis limnológicas e a estrutura da ictiofauna apenas na estação chuvosa, o que pode ser explicado pela diferença marcante nas condições ambientais, especialmente neste período. Os resultados mostram que os efeitos da poluição atuam como uma barreira química para a dispersão de organismos sensíveis, ou menos tolerantes, e demonstram a urgência de implementar medidas de mitigação da poluição na bacia do Rio Tietê.
Interação entre a alta lipogênese decorrente de condições metabólicas com o comportamento de osteoblastos e da célula endotelial desafiados com titânio
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-23) Pinto, Thaís Silva ; Zambuzzi, Willian Fernando ; Instituto de Biociências de Botucatu (IBB)
Biomateriais metálicos, especialmente o titânio, são utilizados como implantes odontológicos e ortopédicos, e dependem de processos como angiogênese e osteogênese para garantir o sucesso na implantação. Embora a utilização desses biomateriais seja bem estabelecida, profissionais de saúde enfrentam desafios, como a prolongada recuperação, sobretudo em indivíduos com metabolismo comprometido, como aqueles diagnosticados com obesidade e síndrome metabólica. O impacto dessas condições no processo de regeneração tecidual e osseointegração ainda é pouco compreendido. Estudos indicam que o metabolismo comprometido está associado a alterações na biologia óssea e vascular, prejudicando o microambiente peri-implante. Este estudo investigou as respostas de células endoteliais e osteoblastos ao titânio com diferentes modificações de superfície, como o duplo ataque ácido (DAE) e o revestimento de nanohidroxiapatita (nHA), em condições de alta lipogênese utilizando modelos com adipócitos, organoides de fígado e hepatócitos. Além disso, analisamos células mesenquimais (MSC) obtidas do fêmur de ratos obesos (Obese) e tratados com farelo de arroz (RB). Os modelos de alta lipogênese com adipócitos, organoides hepáticos e hepatócitos, demonstraram um aumento no número e no tamanho das gotículas de lipídeos intracelulares. A célula endotelial, quando exposta ao titânio e à condição adipogênica, mostrou modulações na expressão dos genes VEGF-R1, MAPKs e IL-6, assim como na proteína SRC. Os osteoblastos, quando diferenciados com meio condicionado por adipócitos, organoides de fígado e hepatócitos, exibiram gotículas de gordura intracelular e modulação na expressão de genes relacionados ao osso em resposta ao titânio. O gene RUNX2 foi amplificado nos osteoblastos tratados com titânio nHA em condições lipogênicas dos adipócitos e hepatócitos. Nas MSCs do fêmur de ratos obesos, observou-se um aumento na expressão do gene Runx2 e uma redução em Ppar-γ, Tgfb1 e Osx. Já o grupo Obese + RB elevou a expressão do gene Bglap. Na célula endotelial o titânio nHA estimulou a expressão de genes como VEGF, eNOS e AKT, resultando em uma maior angiogênese e migração celular, juntamente com um aumento no remodelamento da matriz extracelular. Os titânios testados influenciaram vias relacionadas à angiogênese dependente da via PI3K/AKT. Esta pesquisa apresenta contribuições importantes para o entendimento do impacto da alta lipogênese sobre a resposta de células endoteliais e osteoblastos ao titânio in vitro, assim como as alterações no perfil de expressão gênica das MSCs em um contexto ex vivo com ratos obesos tratados com farelo de arroz (Obese + RB), comprovando que os mecanismos envolvidos no microambiente peri-implantar são impactados nestas condições.
Controle populacional de animais siantrópicos: aspectos morfológicos, funcionais e bioquímicos da contracepção promovida pelo uso de novas vias de administração do dimetanossulfonato de etano para ratos machos Wistar
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-03-01) Barros, Jorge Willian Franco de ; Kempinas, Wilma De Grava
A superpopulação de animais sinantrópicos e errantes cria um cenário caótico para a aplicação de estratégias eficazes de controle populacional. Esses animais, incluindo roedores, circulam livremente nos centros urbanos, reproduzem-se, além de contribuir para a transmissão de patógenos zoonóticos e causarem acidentes. Nesses casos, métodos de castração cirúrgicos são inviáveis, levando à prática de técnicas não humanizadas, que incluem a morte por envenenamento e armadilhas, o que contribui para o sofrimento dos animais, bem como para a causa de desequilíbrios ambientais e ecológicos. Nesse contexto, nosso Laboratório mostrou resultados promissores na indução de infertilidade em ratos de laboratório, após administração oral de dimetanossulfonato de etano (EDS), um agente com conhecida citotoxicidade seletiva em células de Leydig após gavagem e injeções intraperitoneais. Na sequência desses estudos, o presente projeto teve como objetivo avaliar detalhes adicionais do mecanismo de ação desta molécula in vitro, com células de Leydig imortalizadas (Experimento I); avaliar os aspectos morfofuncionais, bioquímicos e contraceptivos da infertilidade promovida pelo EDS, em ratos Wistar machos, utilizando vias alternativas de administração do composto (Experimentos II, III e IV), bem como testar sua possível aplicação em uma abordagem de “mundo real” com exposição simultânea de ratos machos e fêmeas com uma formulação de ração contendo EDS (Experimento V). No experimento I, as células de Leydig R2C e MA-10 foram cultivadas com o EDS, e os efeitos dessa molécula sobre promotores gênicos relacionados à função endócrina dessas células foram avaliados. A exposição ao EDS pode afetar a atividade dos promotores de Star, Insl3 e Gsta3 nessas células. No experimento II, com a administração única do EDS por injeções intratesticulares em ratos machos adultos, ocorreram reduções no ganho de peso na primeira semana após as injeções, bem como mostraram uma drástica queda na fertilidade após 4 semanas das injeções, a qual foi parcialmente revertida após 10 semanas. Além disso, parâmetros espermáticos e a morfologia do testículo e do epidídimo ainda estavam comprometidos mesmo após 11 semanas das injeções. No experimento III, o EDS foi administrado a ratos machos adultos por meio de implantes em tubos Silastic, colocados cirurgicamente no interior do escroto ou subcutaneamente atrás do pescoço. Os resultados neste experimento mostram alterações mais sutis promovida pelo EDS, incluindo redução da motilidade espermática, alterações da morfologia e do tempo de trânsito espermático pelo epidídimo, sem o comprometimento da fertilidade e da estrutura testicular e epididimária. No experimento IV, após um ou duas injeções subcutâneas de EDS em ratos machos adultos, os animais estavam inférteis após 4 ou 10 semanas dos tratamentos, e com 11 semanas, os parâmetros espermáticos, bem como a histologia testicular e epididimária estavam comprometidos. No experimento V, ratos machos e fêmeas receberam EDS na ração ad libitum, e nesta abordagem efeitos e imediatos e intergeracionais foram avaliados. Na geração F0, os ratos machos apresentaram comprometimento dos parâmetros espermáticos, peso dos órgãos reprodutivos, histologia testicular e epididimária e capacidade ejaculatória, enquanto as ratas apresentaram diminuição do peso ovariano e da imunomarcação da proteína StAR. A fertilidade em ratos F0 foi diminuída pelo EDS principalmente devido à exposição de ratos machos a esta molécula. A prole F1, F2 e F3 apresentaram comprometimento reprodutivo mais sutil principalmente nos ciclos estrais de ratas, indicando efeitos intergeracionais promovidos pela exposição parental ao EDS. Juntos, estes dados contribuem para o conhecimento sobre o mecanismo de ação do EDS nas células de Leydig, bem como comprovam seus efeitos anti-fertilidade por diferentes vias, podendo ser um possível candidato seguro, rápido, eficaz e reversível com efeitos contraceptivos em outras espécies sinantrópicas, errantes, selvagens, de estimação e de produção.
Caracterização do transcritoma codificador da metástase cerebral de câncer de pulmão
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-21) Souza, Vanessa das Graças Pereira de ; Reis, Patricia Pintor dos
O câncer de pulmão é uma das fontes mais frequentes de metástases cerebrais (MC). Para câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP), cerca de 7 a 10% dos pacientes apresentam MC no momento do diagnóstico, e 20 a 40% dos pacientes desenvolvem MC durante o curso da doença. Apesar das estratégias de tratamento atualmente disponíveis, o prognóstico dos pacientes permanece desfavorável, com uma sobrevida média de 15 meses para pacientes tratados. Diante desse cenário desafiador, torna-se evidente a necessidade de estudos moleculares em larga escala, visando identificar biomarcadores clinicamente aplicáveis para melhorar o desfecho da doença e o prognóstico dos pacientes. Este trabalho oferece uma visão abrangente do estado da arte no estudo das MC abordando eventos-chave na formação da MC, a influência do microambiente tumoral e determinantes moleculares da progressão. Além disso, a integração de dados de sequenciamento de RNA total (RNA-Seq), microarray e sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-Seq), juntamente com ferramentas avançadas de bioinformática, foi realizada com o objetivo de identificar os mecanismos subjacentes à formação da MC no adenocarcinoma de pulmão, o subtipo histológico mais incidente de CPCNP. A combinação de RNA-Seq e microarray identificou um conjunto de 20 genes associados a MC do adenocarcinoma pulmonar, principalmente relacionados a vias do sistema imune, destacando a importância do sistema imunológico na formação da MC. Adicionalmente, o uso do scRNA-seq permitiu elucidar o microambiente tumoral da MC e de tumores primários de diferentes estadios de progressão, revelando diferenças na infiltração de células imunológicas. Células T foram identificadas como predominantes em tumores primários, enquanto as microglias predominaram nas MC. A análise de enriquecimento de vias revelou que as microglias apresentam uma marcada upregulação da via de sinalização COX, associada à regulação da resposta inflamatória, indicando um potencial papel da inflamação no desenvolvimento das MC. A infiltração de células supressoras mieloides derivadas de polimorfonucleares (PMN-MDSCs) em MC reforça a importância da infiltração de células imunossupressoras na inflamação crônica associada a essas metástases. A interação entre microglias ativadas, células dendríticas CD163+ CD14+, Th17 e PMN-MDSCs sugere um ambiente inflamado imunossupressor nas MC, com implicações na progressão do tumor. A pesquisa também destaca a interligação entre a sinalização JAK-STAT, interleucina-23 (IL-23) e a produção de interleucina 17 (IL-17), mediadas por microglia ativada, células dendríticas CD163+ CD14+ e Th17, evidenciando uma complexa rede molecular e imunológica na formação das MC. Em resumo, este estudo propõe uma abordagem abrangente, integrando dados de sequenciamento de RNA e ferramentas computacionais para compreender as MC de adenocarcinoma de pulmão. A identificação de biomarcadores, a compreensão das vias moleculares e a análise do microambiente tumoral fornecem insights valiosos para o desenvolvimento de terapias mais eficazes e direcionadas, abrindo caminho para avanços significativos no tratamento das metástases cerebrais do câncer de pulmão.
Monitoramento ativo e estudo da eficiência do monitoramento acústico passivo (MAP) como ferramenta para monitorar anuros (Amphibia) em ambientes lóticos no Parque Estadual Itinguçu, Peruibe-SP
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 0023-08-26) Velasco, Isabel Gonzalves ; Silva Filho, Ivan Sergio Nunes
Partindo-se do déficit de informações a respeito da anurofauna brasileira e à luz das emer-gentes técnicas de levantamentos de espécies animais, o presente trabalho escolheu o Par-que Estadual Itinguçu, município de Peruíbe, estado de São Paulo, para levantar dados a respeito dos referidos pontos. O parque configura uma unidade de proteção integral inse-rido no bioma da Mata Atlântica e não possui dados recentes de levantamentos de espé-cies, principalmente de anurofauna, cuja o único estudo foi realizado em 1993. Desta forma, objetivou-se: (i) realizar um levantamento da anurofauna da planície costeira do parque em diferentes categorias de ambientes (cachoeira, trilha, poças e riacho) a partir de encontros visuais realizados durante o dia e durante a noite; e (ii) testar a eficiência dos métodos de monitoramento ativo e monitoramento acústico passivo na detecção da anurofauna em ambientes lóticos. Este trabalho é o primeiro a utilizar o monitoramento acústico passivo para detecção de anurofauna de ambientes lóticos. A coleta de dados foi realizada a cada 45 dias iniciando-se em abril de 2022 e finalizado em fevereiro de 2023. Em suma, o levantamento da anurofauna do parque registrou a presença de 22 espécies de anuros, algumas já haviam sido registradas em 1993 e outras que não se havia registro na área. Os índices aplicados demonstraram crescimento exponencial conforme o au-mento do número de campanhas. Dados de história natural das espécies observadas em campo também foram relatados (distribuição espacial, reprodução e interações interespe-cíficas). Já o teste de eficiência entre os métodos demonstrou que o monitoramento ativo (encontros visuais) apresentou maior eficiência na detecção das espécies em ambientes lóticos do que o monitoramento acústico passivo. Entretanto, foi possível observar que quando essas suas técnicas são utilizadas em conjunto, elas tendem a se complementar e gerar uma coleta de dados muito mais completa.
Avaliação de respostas vasodilatadoras do sulfeto de hidrogênio derivado do tecido adiposo perivascular estimulado com L-Cisteína na disfunção endotelial induzida por hipertensão na gravidez em ratas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-06) Oliveira, Priscilla Bianca de ; Dias Junior, Carlos Alan Candido
Resumo A capacidade de atuação na anticontratilidade do sulfeto de hidrogênio (H2S) derivado do tecido adiposo perivascular (PVAT) em situações fisiológicas é fato, contudo, frente às circunstâncias disfuncionais o H2S pode ter um comportamento diferente. No intuito de compreender melhor a influência do H2S sintetizado pelo PVAT nas respostas anticontráteis na hipertensão gestacional (HG), o nosso grupo de pesquisa em trabalho anterior objetivou analisar essas respostas em ratas prenhes normotensas e hipertensas. Conseguimos notar que na gravidez saudável não há distúrbios no PVAT, em contrapartida na HG o PVAT teve seu efeito anticontrátil atenuado e ainda conseguimos demonstrar que o efeito anticontrátil atribuído ao PVAT é dependente dos canais de potássio sensíveis ao ATP, ressaltando que essa é a via utilizada pelo H2S. Por fim ainda nesse estudo detectamos que ao contrário do endotélio o PVAT é reativo à produção de H2S na HG e esse fato está correlacionado com instabilidade na angiogênese bem como com a diminuição de crescimento fetal e placentário. Após esse estudo ambicionamos conhecer as respostas vasculares com olhar principalmente voltado ao vasorrelaxamento frente a uma estimulação na síntese sulfeto de hidrogênio derivado do PVAT incluindo ratas virgens para resultados mais consistentes. Dessa forma o propósito desse estudo foi verificar possíveis modificações de respostas vasodilatadoras do H2S derivado do PVAT na disfunção endotelial induzida pela hipertensão gestacional e, além disso, minuciar a participação do H2S derivado do PVAT na reatividade vascular ao final da gestação.
Estudos sobre o efeito do nocaute e da superexpressão do componente RNA da telomerase (LeishTER) nos telômeros, no desenvolvimento e na sobrevida de Leishmania major
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-01-25) Oliveira, Beatriz Cristina Dias de ; Cano, Maria Isabel Nogueira
Parasitos do gênero Leishmania causam leishmaniose, uma doença tropical negligenciada que afeta pessoas em todo o mundo. A doença apresenta diferentes manifestações clínicas, alta taxa de incidência e vai desde lesões auto curáveis até a forma letal, conhecida como leishmaniose visceral. Apesar de muitos esforços, até agora não existem vacinas e protocolos de tratamento eficientes disponíveis e, portanto, encontrar novos alvos terapêuticos é crucial. Os telômeros, extremidades físicas dos cromossomos de eucariotos, são essenciais para manter a estabilidade do genoma e têm sido considerados alvos potenciais contra parasitos. Em Leishmania spp. os telômeros são compostos por repetições conservadas do tipo TTAGGG, mantidas pela telomerase, uma ribonucleoproteína minimamente composta pelos componentes TERT (transcriptase reversa da telomerase) e TER (RNA da telomerase). Na maioria dos eucariotos o TER é uma molécula única e contém a sequência molde copiada pela TERT durante a elongação dos telômeros. Sua estrutura secundária contém domínios com funções de controle da inserção de nucleotídeos pela TERT, reconhecimento da sequência telomérica e de ligação com proteínas acessórias. Em 2014 nosso grupo identificou e caracterizou parcialmente o componente TER da telomerase de Leishmania (LeishTER). O presente trabalho visa desvendar os papéis biológicos desempenhados pelo componente TER de Leishmania major (LeishTER) na homeostase do parasito. Para isso obtivemos uma linhagem celular knockout (LmTER-/-) que apresentou alterações no perfil de proliferação do parasito, divisão celular e replicação do DNA, principalmente nas primeiras passagens in vitro. Durante o crescimento contínuo, LmTER-/- apresentou arrest parcial do ciclo celular G0/G1, encurtamento progressivo dos telômeros e maior porcentagem de fosforilação da histona γH2A. Além disso, alterações ultraestruturais características da autofagia foram detectadas sem que as células apresentassem danos no DNA ou fenótipos de apoptose. LmTER-/- promastigotas diferenciam-se em metacíclicos apresentando índice de infectividade in vitro menor que o controle Lm007. Curiosamente, o addback de LeishTER não retornou o comprimento dos telômeros aos níveis do tipo selvagem, corroborando resultados preliminares que mostram que a expressão epissomal de TER, semelhante à sua ablação, tem um efeito negativo dominante na vida do parasito, o que pode ser um potencial alvo terapêutico contra a leishmaniose. Além disso, resultados preliminares que visam acessar a estrutura secundária de LeishTER através da acilação seletiva de 2'-hidroxila analisada por extensão de primer e perfil mutacional (SHAPE MaP) com o uso de 2-metilnicotínico imidazolide (NAI) confirmaram algumas estruturas já descritas pelo nosso grupo, incluindo a Hélice II (TBE), o molde e a hélice proximal ao modelo (TPH). A estrutura inicial de ~100 nt de LeishTER se assemelhou à de TbTR (TER de Trypanosoma brucei), com um motivo 5' CCGUCA 3' na extremidade 3' proximal a TBE, similar a TBE de Tetrahymena thermophila. Nucleotídeos na base de TPH mostraram baixa reatividade, indicando rigidez, enquanto o ápice apresentou reatividade. O molde de LeishTER compreende principalmente elementos de cadeia simples, exceto por alguns nucleotídeos que sugerem envolvimento em interações de longo alcance ou transitórias. Entretanto, experimentos adicionais são necessários para confirmação e uma compreensão completa da estrutura de LeishTER.
Morfologia do sistema reprodutor feminino da perdiz : Rhynchotus rufescens
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-01-17) Sandei, Mariana Furian ; Filadelpho, André Luis
Conhecida popularmente como Perdiz, a Rhynchotus rufescens, é uma ave nativa brasileira que está em processo de domesticação, tem ampla dispersão geográfica, hábito alimentar onívoro e capacidade cinegética. Essa espécie não apresenta dimorfismo sexual aparente, que permita diferenciar machos e fêmeas. Sofrem alterações morfológicas sexuais sazonais, sendo o período reprodutivo de agosto a março. Neste estudo foram utilizadas 4 fêmeas, fornecidos pelo curso de Zootecnia da Unesp-Botucatu. Realizou-se os exames imagenológicos de radiografia nas projeções ventro-dorsal e laterais direita e esquerda. Para análise macroscópica, o animal foi posicionado em decúbito dorsal, com os membros afastados para estabilizar a carcaça. Foi realizado uma incisão com lâmina de bisturi nº24 longitudinal na pele, no plano sagital mediano, da região mentoniana até a cloaca, rebatendo toda pele e subcutâneo até expor a cavidade celomática, com o auxílio de uma tesoura fina/romba curva. Removeu-se então todo o conjunto de musculaturas para ter acesso aos órgãos da cavidade celomática e feito o registro com foto documentação. Nos exames de imagem não foi possível a visibilização dos órgãos sexuais femininos. Enquanto na dissecação, devido as alterações sazonais e de maturidade sexual, nem todos os órgãos do sistema reprodutor foram visualizados, sendo em 2 fêmeas adultas observados todas as estruturas sexuais reprodutivas, 1 fêmea adulta, porem fora do período reprodutivo, foi observado somente o ovário, e 1 fêmea imatura, onde não foi possível diferenciar nenhum órgão sexual. Sendo necessário mais estudos e em estações reprodutivas, para mais resultados.
Sequenciamento de nova geração em Myracrodruon urundeuva Allemão LC (Anacardiaceae) de diferentes biomas do Brasil
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-12-06) Alcantara, Marcelo Augusto Mendes ; Marino, Celso Luis ; Rossini, Bruno Cesar
A variabilidade genética intrínseca às espécies é vital para sua adaptação ambiental e o Brasil, detentor de seis biomas terrestres distintos, se destaca neste panorama. Entretanto, muitas espécies nativas brasileiras, como Myracrodruon urundeuva, carecem de descrição do genoma, dificultando a busca por marcadores SNPs e um maior entendimento da espéice. O Double Digest Restriction Associated DNA Sequencing (ddRADseq) por sua vez, emerge como uma abordagem valiosa, não dependendo de informações genômicas prévias, oferecendo potencial para futuros estudos genéticos, mesmo sem um genoma de referência. Tendo em vista este panorama, o presente trabalho tem como objetivos estabelecer um panorama biológico e histórico-social de M. urundeuva, conhecida como Aroeira, destacando sua distribuição geográfica, utilização e pesquisa. Em seguida, utilizando o sequenciamento por ddRADseq, busca-se construir uma biblioteca genômica a partir de amostras coletadas em quatro biomas e em um ecótono entre Cerrado e Mata-Atlântica. O foco está na compreensão da diversidade genética, distâncias entre populações e possível relação entre Marcadores SNPs e variáveis climáticas nos biomas de ocorrência da espécie. Para o estudo, foram coletadas amostras foliares de 115 indivíduos de M. urundeuva de quatro biomas, incluindo Caatinga, Cerrado, Mata-Atlântica e Pantanal, além do ecótono entre Cerrado e Mata-Atlântica. A extração do DNA genômico seguiu o protocolo adaptado de Doyle & Doyle (1990). A construção das bibliotecas de sequenciamento foi realizada conforme o protocolo de ddRAD proposto por Campos et al. (2017) e Peterson et al. (2012). O software STACKS v2.71 foi utilizado para identificar loci SNP nos indivíduos sequenciados. Análises estatísticas, incluindo DAPC, PCA, AMOVA, Teste de Mantel, Fis e Fst foram conduzidas utilizando pacotes R específicos. A estrutura populacional foi identificada pelo software fineRAD. A Rede de Haplótipos, Coeficiente de Endogamia (Fis) e a identificação de loci com potencial envolvimento em adaptação foram analisados usando pacotes especializados como 'poppr', 'hierfstat', 'pcadapt' e Análise de Redundância (RDA) com 'psych' e 'vegan' em ambiente R. O Sequenciamento resultou em 86,040,542 milhões de reads, com variação entre 264 e 2,667,829 milhões de reads por amostra. Após a criação do catálogo de marcadores, 88 amostras foram selecionadas, resultando em 1427 marcadores SNPs. A população de Seridó, Caatinga, apresentou 134 alelos privados, e a média de riqueza alélica foi 1.227 para as populações avaliadas. O Coeficiente de Endogamia (Fis) variou de 0.001 a 0.196. A diversidade genética revelou estruturação distinta entre as populações dos biomas Caatinga, Mata-Atlântica e Pantanal, enquanto Cerrado e transição de biomas formaram um único cluster. As populações mostraram diferenças significativas no Coeficiente de Fixação de Wright (Fst) e distância genética, indicando diferenciação entre a Caatinga e as demais populações. A significativa divergência genética das populações da Caatinga destaca a necessidade de maior investigação neste bioma. O estudo enfatiza a importância da preservação da diversidade genética de M. urundeuva, sugerindo estratégias de conservação e manejo sustentável. Abordagens moleculares inovadoras são pertinentes para garantir um futuro promissor para esta espécie nativa de relevância econômica e ambiental.
Descrição e avaliação funcional de um novo subtipo de TccP (Tir cytoskeleton coupling protein) na formação da lesão attaching and effacing, independentemente de Nck, em um isolado de Escherichia albertii
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 0030-11-23) Iranildo do Amarante Fernandes ; Hernandes, Rodrigo Tavanelli ; Amaral, Tânia Aparecida Tardelli Gomes do ; Instituto de Biociências de Botucatu
A espécie Escherichia albertii compreende o mais novo membro do gênero Escherichia e é responsável por casos esporádicos, bem como surtos de diarreia em diversos países do mundo, incluindo o Brasil. Uma das principais características de virulência observada em isolados classificados como pertencentes à espécie E. albertii é a formação da lesão attaching and effacing (AE), que é caracterizada pela aderência íntima da bactéria às células epiteliais, destruição das microvilosidades e formação de uma estrutura semelhante a um pedestal rico em F-actina e outros elementos do citoesqueleto eucariótico. Estudos anteriores, realizados com o protótipo brasileiro de E. albertii 1551-2, mostraram que esse patógeno possui a capacidade de recrutar F-actina para a formação da lesão AE utilizando tanto a via Nck-dependente, que requer a fosforilação do resíduo de Tirosina Y474 na proteína receptora Tir, quanto a via Nck-independente, que utiliza a proteína adaptadora TccP (Tir-cytoskeleton coupling protein). Estudos anteriores identificaram um novo subtipo de TccP no isolado de E. albertii 1551-2 (denominado TccP3), cujo papel na formação da lesão AE se mostrou minoritário. Análises posteriores do genoma do isolado de E. albertii 1551-2 revelaram que, além de TccP3, esse isolado alberga um gene com potencial para codificar um novo TccP. Frente ao exposto, nossos objetivos foram avaliar a relação desse novo TccP com os subtipos de TccP já descritos até o momento, bem como a participação dessa nova proteína na formação da lesão AE pela via independente de Nck. Uma árvore de máxima verossimilhança foi construída comparando as sequências de aminoácidos dos diferentes subtipos de TccP e a sequência do novo TccP encontrado no isolado 1551-2. Posteriormente, foram realizadas a mutagênese e complementação in trans do gene responsável por codificar essa nova proteína a partir do mutante 1551-2tccP3. Sequenciamento Sanger e Immunoblotting foram realizados para confirmação da mutagênese e complementação, respectivamente. Em desfecho, foram realizados testes quantitativos de FAS (Fluorescent actin staining) em células MEF (Mouse Embrionic Fibroblast) desprovidas de Nck e infectadas com as bactérias empregadas neste estudo. A nova proteína TccP identificada nesse estudo, está localizada em um clado diferente na árvore de máxima verossimilhança e apresentou identidade inferior a 80% se comparada com outros subtipos de TccP. Tais resultados indicam, portanto, se tratar de um novo subtipo de TccP, denominado neste estudo de TccP4. A deleção do gene tccP4 foi confirmada por sequenciamento bem como pela produção da proteína recombinante TccP4-Myc no isolado complementado por Immunoblotting com o soro anti-Myc. Os testes quantitativos mostraram que 64,7% das bactérias selvagens aderidas eram capazes de recrutar F-actina para a formação do pedestal característico da lesão AE, enquanto, apenas 5,0% dos isolados de E. albertii mutados em tccP4 (1551-2tccP3/tccP4) mostraram esse fenótipo, sendo essa diferença considerada significativa pelo teste de ANOVA (P < 0.0001). A complementação in trans restaurou a capacidade do isolado 1551-2tccP3/tccP4 (pTccP4) em recrutar F-actina em porcentagens semelhantes às observadas com o isolado selvagem (64,7% vs. 52,6%; P = 0.3846). Tais evidências vêm a corroborar o papel da proteína adaptadora TccP4 no recrutamento de F-actina, pela via Nck-independente, para a formação da lesão AE durante o estabelecimento do processo infeccioso por E. albertii.

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