Produção de Pfu DNA Polimerase por Escherichia coli

Abstract

A produção de proteínas recombinantes em sistemas microbianos revolucionou a biotecnologia ao viabilizar a obtenção de biomoléculas com alto grau de pureza, aplicáveis em diferentes áreas como diagnóstico, pesquisa e indústria. Entre essas proteínas, destaca-se a Pfu DNA Polimerase, enzima originária da arqueobactéria Pyrococcus furiosus, amplamente empregada em técnicas de biologia molecular pela sua elevada fidelidade na replicação do DNA. Neste trabalho, objetivou-se quantificar a enzima Pfu DNA Polimerase por meio de cultivo de Escherichia coli, avaliando parâmetros relacionados ao crescimento celular, consumo de substratos e concentração proteica. A metodologia adotada envolveu a indução da expressão gênica em meio de cultivo líquido, com coleta de amostras em diferentes tempos de incubação para monitoramento do processo. A quantificação das proteínas totais foi realizada por meio do método de Bradford, utilizando uma curva de calibração com albumina bovina (BSA) e análise de regressão linear no software Microsoft Excel®. Ensaios em biorreator também foram conduzidos, com controle de pH, temperatura e aeração, além do acompanhamento do consumo de lactose e glicerol como fontes de carbono. Os resultados demonstraram crescimento celular adequado e consumo completo do glicerol, indicando sua viabilidade como fonte energética. A lactose, por sua vez, não foi metabolizada, sugerindo ter atuado exclusivamente como indutor. Contudo, a ausência da banda correspondente à enzima nas análises de SDS-PAGE indicou que não houve produção detectável da Pfu DNA Polimerase nas condições avaliadas. Tal resultado pode estar relacionado a falhas na indução, limitações nutricionais do meio, instabilidades no sistema de expressão, ou ainda a interferências técnicas durante as etapas de purificação e visualização por eletroforese.

The production of recombinant proteins in microbial systems has revolutionized biotechnology by enabling the acquisition of biomolecules with a high degree of purity, applicable in various fields such as diagnostics, research, and industry. Among these proteins, Pfu DNA Polymerase stands out—a thermostable enzyme derived from the archaeon Pyrococcus furiosus, widely used in molecular biology techniques due to its high fidelity in DNA replication. This study aimed to quantify the Pfu DNA Polymerase enzyme through the cultivation of Escherichia coli, evaluating parameters related to cell growth, substrate consumption, and protein concentration. The adopted methodology involved the induction of gene expression in liquid culture medium, with sample collection at different incubation times to monitor the process. Total protein quantification was performed using the Bradford method, with a calibration curve based on bovine serum albumin (BSA) and linear regression analysis conducted in Microsoft Excel®. Bioreactor assays were also carried out under controlled pH, temperature, and aeration, along with monitoring the consumption of lactose and glycerol as carbon sources. The results demonstrated proper cell growth and complete consumption of glycerol, indicating its viability as an energy source. Lactose, on the other hand, was not metabolized, suggesting it acted solely as an inducer. However, the absence of a band corresponding to the enzyme in SDS-PAGE analyses indicated no detectable production of Pfu DNA Polymerase under the evaluated conditions. This result may be related to induction failures, nutritional limitations of the medium, instabilities in the expression system, or technical interferences during the purification and electrophoresis visualization steps.