Resistome composition and distribution in broiler chicken production raised under conventional and antibiotic-free systems

Os sistemas de produção de frangos de corte, devido à sua escala e intensidade produtiva, constituem uma interface ecológica para a disseminação de genes de resistência aos antimicrobianos (ARGs). Esta tese foi estruturada em dois capítulos e investigou a dinâmica de circulação do resistoma ao longo da cadeia produtiva de frangos de corte sob sistemas convencionais (CS) e antibiotic-free (AFS) no sudeste do Brasil. No Capítulo 1, avaliou-se a distribuição, diversidade e persistência dos ARGs ao longo da cadeia produtiva. Um total de 120 amostras foi coletado ao longo de dois anos, provenientes de 32 lotes comerciais de frangos de corte (CS, n = 16; AFS, n = 16), distribuídos em oito granjas verticalmente integradas (quatro CS e quatro AFS). A amostragem incluiu ambientes de aviários, conteúdos cecais, superfícies de abatedouros, produtos finais (lavagens de carcaça) e amostras fecais de trabalhadores das granjas e dos abatedouros. O DNA total foi extraído utilizando um kit comercial e bibliotecas metagenômicas shotgun foram preparadas e sequenciadas na plataforma Illumina NextSeq. Após filtragem de qualidade e trimming, sequências associadas ao hospedeiro foram removidas por mapeamento contra os genomas de referência Gallus gallus (GRCg6a) e Homo sapiens (GRCh38). O perfil de ARGs foi obtido utilizando o ARGs-OAP v2.3, e a abundância foi normalizada como cópias gênicas por célula. As análises estatísticas incluíram testes de Wilcoxon com correção por FDR, índices de diversidade alfa, diversidade beta baseada nas distâncias de Bray–Curtis e Jaccard, análises de ordenação (PCoA e NMDS) e PERMANOVA. Ao longo da cadeia produtiva, foram detectados 1.349 subtipos de ARGs, pertencentes a 27 classes de resistência, com predominância de genes de resistência a macrolídeos–lincosamidas–estreptograminas (MLS), beta-lactâmicos, aminoglicosídeos e tetraciclinas em ambos os sistemas. Embora 77% dos subtipos de ARGs fossem compartilhados entre os sistemas, o sistema convencional apresentou maior riqueza de ARGs, enquanto o sistema antibiotic-free exibiu maior equitabilidade, indicando uma estrutura de resistoma mais uniforme. As análises de diversidade beta revelaram diferenças significativas entre os sistemas (p < 0,001). Genes clinicamente relevantes, incluindo erm(C), optrA, fexA, tet(X5) e TEM-117, foram detectados exclusivamente no sistema convencional, enquanto mecA e vanYG1 foram identificados no sistema antibiotic-free. ARGs centrais (core ARGs) foram detectados em todas as etapas produtivas, indicando circulação contínua independentemente do uso de antimicrobianos. As amostras fecais humanas apresentaram resistomas semelhantes aos ambientais, e trabalhadores do sistema convencional exibiram maiores abundâncias de genes de resistência a tetraciclinas, beta-lactâmicos e MLS, demonstrando a exposição ocupacional como um fator relevante na disseminação de ARGs. O Capítulo 2 avaliou a ração como um nicho ecológico para a disseminação microbiana e genética nos sistemas de produção de frangos de corte. Dezesseis amostras de ração (oito por sistema) foram coletadas durante o inverno de 2024 e o verão de 2025 e analisadas por metagenômica shotgun, seguindo o mesmo fluxo de extração de DNA e sequenciamento descrito no Capítulo 1. Os perfis da comunidade microbiana foram dominados por Proteobacteria, Actinobacteria e Firmicutes em ambos os sistemas. As rações do sistema convencional apresentaram enriquecimento em Yaniella, Aureimonas e Lactobacillus, gêneros associados à contaminação industrial e derivada de processos, enquanto as rações antibiotic-free foram dominadas por gêneros ambientais e associados a biofilmes, como Sphingomonas, Corynebacterium e Streptomyces. Embora a diversidade alfa não tenha diferido significativamente entre os sistemas, as rações antibiotic-free exibiram comunidades mais uniformemente estruturadas. As análises de diversidade beta revelaram uma segregação clara entre os sistemas (p < 0,01). Um total de 283 ARGs, pertencentes a 27 classes de resistência, foi detectado nas rações. O sistema convencional foi dominado por bacA, enquanto as rações antibiotic-free apresentaram maior riqueza de ARGs e diversidade funcional, com enriquecimento em genes de resistência a MLS, fenicóis e aminoglicosídeos. Genes de bombas de efluxo (MFS, mdtK) e o determinante de resistência a biocidas qacG foram ubíquos, sugerindo co-seleção mediada por desinfetantes e metais. Os efeitos sazonais influenciaram moderadamente a estrutura microbiana, mas exerceram impacto limitado sobre o resistoma. De forma geral, os resultados demonstram que a resistência aos antimicrobianos (RAM) nos sistemas de produção de frangos de corte é governada por pressões multifatoriais que envolvem o uso de antimicrobianos, a exposição ambiental, a microbiologia da ração e o contato ocupacional. Embora os sistemas antibiotic-free reduzam a abundância e a diversidade de ARGs, eles não eliminam o resistoma persistente. Esta tese destaca a ração como uma interface ecológica relevante e ainda pouco explorada na rede de disseminação da RAM e reforça a necessidade de estratégias integradas de vigilância para mitigar a resistência aos antimicrobianos ao longo da cadeia de produção de alimentos.

Resumo (inglês)

Broiler production systems, due to their scale of production and intensity, constitute an ecological interface for the dissemination of antimicrobial resistance genes (ARGs). This thesis was structured into two chapters and investigated the dynamics of resistome circulation across the broiler production chain under conventional (CS) and antibiotic-free systems (AFS) in southeastern Brazil. In Chapter 1 we evaluated the distribution, diversity, and persistence of ARGs along the broiler production chain. A total of 120 samples were collected over two years from 32 commercial broiler batches (CS, n = 16; AFS, n = 16) across eight vertically integrated farms (four CS and four AFS). Sampling included poultry house environments, cecal contents, slaughterhouse surfaces, final products (carcass rinsates), and fecal samples from farm and slaughterhouse workers. Total DNA was extracted using a commercial Kit, and shotgun metagenomic libraries were prepared and sequenced on an Illumina NextSeq platform. After quality filtering and trimming, host-associated sequences were removed by mapping against Gallus gallus (GRCg6a) and Homo sapiens (GRCh38) reference genomes. ARG profiling was conducted with ARGs-OAP v2.3, and abundance was normalized as gene copies per cell. Statistical analyses included Wilcoxon tests with FDR correction, alpha diversity indices, beta diversity based on Bray–Curtis and Jaccard distances, ordination analyses (PCoA and NMDS), and PERMANOVA. A total of 1,349 ARG subtypes belonging to 27 resistance classes were detected across the production chain, with macrolide–lincosamide–streptogramin (MLS), beta-lactam, aminoglycoside, and tetracycline resistance genes predominating in both systems. Although 77% of ARG subtypes were shared between systems, the conventional system exhibited greater ARG richness, whereas the antibiotic-free system showed greater evenness, indicating a more uniform resistome structure. Beta-diversity analyses revealed differences between systems (p < 0.001). Clinically relevant genes, including erm(C), optrA, fexA, tet(X5), and TEM-117, were exclusively detected in CS, while mecA and vanYG1 were identified in AFS. Core ARGs were detected across all production stages, indicating continuous circulation independent of antimicrobial use. Human fecal samples showed similar environmental resistomes, and workers from CS harbored higher abundances of tetracycline, beta-lactam, and MLS resistance genes, demonstrating occupational exposure as a relevant driver of ARG dissemination. Chapter 2 assessed feed as an ecological niche for microbial and genetic dissemination within broiler production systems. Sixteen feed samples (eight per system) were collected during winter 2024 and summer 2025 and analyzed by shotgun metagenomics following the same DNA extraction and sequencing workflow applied in Chapter 1. Microbial community profiles were dominated by Proteobacteria, Actinobacteria, and Firmicutes in both systems. Conventional feeds were enriched in Yaniella, Aureimonas, and Lactobacillus, which are associated with industrial and process-derived contamination, whereas antibiotic-free feeds were dominated by environmental and biofilm-associated genera such as Sphingomonas, Corynebacterium, and Streptomyces. Although alpha diversity did not differ significantly between systems, antibiotic-free feeds exhibited more evenly structured communities. Beta-diversity analyses revealed clear system-level segregation (p < 0.01). A total of 283 ARGs belonging to 27 resistance classes were detected in feed. The conventional system was dominated by bacA, whereas antibiotic-free feeds showed significantly greater ARG richness and functional diversity, with enrichment in MLS, phenicol, and aminoglycoside resistance genes. Efflux pump genes (MFS, mdtK) and biocide resistance determinant qacG were ubiquitous, suggesting co-selection mediated by disinfectants and metals. Seasonal effects moderately influenced microbial structure but exerted a limited impact on the resistome. Altogether, the results demonstrate that antimicrobial resistance (AMR) in broiler production systems is governed by multifactorial pressures involving antimicrobial use, environmental exposure, feed microbiology, and occupational contact. Although antibiotic-free systems reduce ARG abundance and diversity, they do not eliminate the persistent resistome. This thesis highlights feed as an underexplored yet relevant ecological interface in the AMR network and reinforces the need for integrated surveillance strategies to mitigate antimicrobial resistance across the food production chain.

Palavras-chave

ARGs, Food safety, Public health, Food microbiology

Idioma

Inglês

Citação

SANTOS, Emanoelli Aparecida Rodrigues dos. Resistome composition and distribution in broiler chicken production raised under conventional and antibiotic-free systems. 2025. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, 2026.