Análise estrutural de diferentes técnicas de preservação de membrana amniótica para uso em oftalmologia

Abstract

Introdução: Membrana amniótica é a camada mais interna das três que constituem as membranas fetais e possui capacidade de gerar cicatrização, epitelização e antiin-flamação quando utilizada como curativo biológico. A aplicação em oftalmologia tem crescido nos últimos anos, já sendo relatado seu uso para reconstrução de superfície ocular, cirurgias de pterígio, perfurações corneanas, defeitos epiteliais corneanos per-sistentes, ceratite infecciosa e em tratamento de queimadura ocular. O método de con-servação mais empregado é a criopreservação com glicerol, mantendo a membrana armazenada a -80°C. O principal obstáculo deste método é a necessidade de um con-gelador caro e pouco disponível. Nosso objetivo neste estudo é avaliar diferenças es-truturais de fragmentos de membrana amniótica submetidos a diferentes processos de preservação para uso em oftalmologia. Material e métodos: Foram coletadas três placentas de doadoras saudáveis e preparados fragmentos de membrana amniótica distribuídos em quatro grupos com três fragmentos cada, sendo um de cada doadora. Um dos grupos foi criopreservado, outro grupo liofilizado, terceiro grupo seco a vá-cuo com SpeedVac e quarto grupo mantida fresca. Após os processamentos, os fra-gmentos foram fixados, lâminas foram confeccionadas e a morfologia do tecido ava-liada em microscopia eletrônica de transmissão (MET) e varredura (MEV). Os teci-dos foram avaliados a partir de seis indicadores: morfologia do núcleo, preservação da membrana basal e camada de colágeno, presença de desmossomos e organelas, in-tegridade das vilosidades apicais. Resultados e discussão: Os seis indicadores esta-belecidos na metodologia foram preenchidos em todas as amostras na análise de MET. Não houve diferença nos parâmetros avaliados entre as amostras estudas, ou seja, a morfologia das membranas liofilizadas, criopreservada e seca a vácuo foi se-melhante a membrana fresca. No entanto, a secagem à vácuo apresenta-se como a mais factível, tendo em vista a constante disponibilidade da membrana a qualquer momento e armazenamento à temperatura ambiente para uso oftalmológico. Conclu-são: A secagem a vácuo com SpeedVacTM, liofilização e criopreservação mantêm ca-racterísticas morfológicas da Mah semelhante a amostra fresca. Podemos estabelecer protocolo de uso de SpeedVacTM para secagem de membrana amniótica humana pe-las razões de facilidade de armazenamento e facilidade de acesso.

Introduction: Amniotic membrane is the innermost layer of the three that make up the fetal membranes and it has the capacity to generate healing, epithelialization and antiinflammatory effects when used as a biological dressing. Its application in ophthalmology has grown in recent years, with reports of its use in ocular surface reconstruction, pterygium surgery, corneal perforations, persistent corneal epithelial defects, infectious keratitis and in the treatment of ocular burns. The most widely used preservation method is cryopreservation with glycerol, keeping the membrane stored at -80°C. The main obstacle to this method is the need for an expensive and unavailable freezer. The aim of this study was to evaluate structural differences in amniotic membrane fragments submitted to different preservation processes for use in ophthalmology. Materials and methods: Three placentas were collected from healthy donors and four amniotic membrane fragments were prepared from each placenta, divided into 4 groups with 3 fragments each. One of the groups was cryopreserved, another was freeze-dried, the third was vacuum-dried with SpeedVac and the fourth was kept fresh. After processing, the fragments were fixed, slides were prepared and the morphology of the tissue was assessed using scanning transmission electron microscopy. Results and discussion: The tissues were assessed for nuclear morphology, preservation of the basement membrane and collagen layer, presence of desmosomes and organelles. All the criteria were met in all the samples. There was no difference in the parameters assessed among the samples studied, the morphology of the freeze-dried and vacuum-dried membranes was similar to the cryopreserved and fresh membranes. However, vacuum drying appears to be the most feasible, given the constant availability of the membrane at any time, storage at room temperature, for ophthalmic use. Conclusion: Vacuum drying with SpeedVacTM, freeze-drying and cryopreservation maintain the morphological characteristics of the Mah similar to the fresh sample. We can establish a protocol for using SpeedVacTM to dry human amniotic membrane for reasons of ease of storage and ease of access.