Relação entre as proteínas mitocondriais espermáticas e a fertilidade in vivo de bovinos

Mitocôndrias desempenham papel central na fisiologia espermática, sustentando a motilidade flagelar pela produção de ATP, regulando o balanço redox e assegurando a integridade celular. Dois estudos complementares foram conduzidos com o objetivo de aprofundar o conhecimento sobre o proteoma mitocondrial de espermatozoides bovinos e sua associação com a fertilidade. No primeiro estudo, caracterizou-se o proteoma mitocondrial a partir da aplicação de um protocolo otimizado de isolamento por centrifugação diferencial em tampão de sacarose, utilizando sêmen comercial congelado de 11 touros Nelore. Análises por microscopia eletrônica de transmissão e espectrometria de massas (LC-MS/MS) foram realizadas. Um total de 776 proteínas foram identificadas nos pellets mitocondriais e frações sobrenadantes, incluindo 213 com anotação mitocondrial, relacionadas a vias centrais como OXPHOS, ciclo do ácido tricarboxílico (TCA), glicólise/gliconeogênese, β-oxidação e metabolismo de aminoácidos de cadeia ramificada, além da detecção de 10 proteínas mitocondriais não previamente descritas em espermatozoides bovinos. A presença de proteínas mitocondriais nas frações sobrenadantes evidenciou limitações metodológicas e a complexidade estrutural da interface entre mitocôndrias e o citoesqueleto flagelar. No segundo estudo, os mesmos touros foram agrupados de acordo com taxas de prenhez obtidas por inseminação artificial em tempo fixo (IATF), sendo cinco de alta fertilidade (HF) e seis de baixa fertilidade (LF), totalizando 8.286 vacas inseminadas. A qualidade do sêmen foi avaliada por análise computadorizada (CASA), integridade de membrana, potencial mitocondrial e indicadores de estresse oxidativo. A análise proteômica, aliada a métodos multivariados, ontologia gênica, enriquecimento KEGG e correlação de Spearman com parâmetros espermáticos, identificou 495 proteínas, das quais 25 apresentaram abundância diferencial entre os grupos. Touros HF apresentaram maior abundância de proteínas associadas à arquitetura das cristas mitocondriais e ao transporte redox, sugerindo um sistema bioenergético mais eficiente e regulado. Por outro lado, touros LF exibiram maior abundância de proteínas envolvidas na importação de precursores nucleares, subunidades do complexo I e componentes do proteassoma, indicando estresse mitocondrial e prejuízo na proteostase. Os achados ampliam o conhecimento sobre a produção bioenergética espermática, revelam a plasticidade metabólica das mitocôndrias e identificam assinaturas moleculares associadas à fertilidade in vivo, oferecendo novas perspectivas para a compreensão da biologia espermática bovina e a seleção de reprodutores com maior eficiência reprodutiva.

Resumo (inglês)

Mitochondria play a central role in sperm physiology by sustaining flagellar motility through ATP production, regulating redox balance, and maintaining cellular integrity. Two complementary studies were conducted to deepen our understanding of the mitochondrial proteome in bovine spermatozoa and its association with fertility. In the first study, the mitochondrial proteome was characterized using an optimized isolation protocol based on differential centrifugation in sucrose buffer, applied to commercially frozen semen samples from 11 Nellore bulls. Transmission electron microscopy (TEM) and high-resolution mass spectrometry (LC-MS/MS) were employed. A total of 776 proteins were identified across mitochondrial pellets and supernatant fractions, including 213 with mitochondrial annotation, related to core metabolic pathways such as OXPHOS, the tricarboxylic acid (TCA) cycle, glycolysis/gluconeogenesis, β-oxidation, and branched-chain amino acid metabolism. Notably, 10 mitochondrial proteins had not been previously reported in bovine sperm. The detection of mitochondrial proteins in the supernatant fractions highlighted methodological limitations and the structural complexity of the interface between mitochondria and the flagellar cytoskeleton. In the second study, the same bulls were categorized according to pregnancy rates obtained via fixed-time artificial insemination (FTAI), with five classified as high fertility (HF) and six as low fertility (LF), totaling 8,286 inseminated cows. Semen quality was assessed through computer-assisted sperm analysis (CASA), membrane integrity, mitochondrial membrane potential, and oxidative stress indicators. Proteomic analysis, combined with multivariate statistics, gene ontology enrichment, KEGG pathway analysis, and Spearman correlation with sperm parameters, identified 495 proteins, of which 25 showed differential abundance between groups. HF bulls exhibited increased levels of proteins involved in mitochondrial cristae organization and redox transport, suggesting a more efficient and tightly regulated bioenergetic system. Conversely, LF bulls showed higher abundance of proteins related to the import of nuclear-encoded precursors, Complex I subunits, and proteasome components, findings consistent with mitochondrial stress and impaired proteostasis. These results expand our understanding of sperm bioenergetics, highlight the metabolic plasticity of bovine mitochondria, and reveal molecular signatures associated with in vivo fertility, offering new insights for the selection of more reproductively efficient sires.

Palavras-chave

Mitocondria, Reprodução animal, Proteômica, Bioenergética, Bovinos, Differential centrifugation, Bioenergetics;, Cattle

Idioma

Português

Citação

HAYEK-MARTINS, Yasmin El. Relação entre as proteínas mitocondriais espermáticas e a fertilidade in vivo de bovinos. Orientadora: Fabiana Ferreira de Souza, 2025. 208p. Tese (Doutorado em Biotecnologia Animal) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, 2025.