Além da presença: contribuições da abundância absoluta de Gardnerella vaginalis e Fannyhessea vaginae para a resposta inflamatória vaginal
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Data
Autores
Orientador
Silva, Márcia Guimarães da 
Coorientador
Silva, Mariana de Castro
Pós-graduação
Patologia - FMB
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Dissertação de mestrado
Direito de acesso
Acesso aberto
Resumo
Resumo (português)
Introdução: A microbiota vaginal saudável, predominada por espécies lactobacilares, em mulheres na menacme, possui importante papel para o equilíbrio da saúde reprodutiva feminina, possibilitando um microambiente protetivo contra patógenos causadores de infecções sexualmente transmissíveis (ISTs) e hostil ao crescimento de outras espécies bacterianas. Por ser um ambiente dinâmico, a microbiota vaginal pode sofrer alterações. Desequilíbrios na microbiota vaginal podem levar à ocorrência da vaginose bacteriana (VB), uma disbiose clássica, comum em mulheres em idade reprodutiva, caracterizada pela redução ou ausência de Lactobacillus spp., juntamente com o aumento da abundância de espécies bacterianas anaeróbias facultativas, como Gardnerella vaginalis, Fannyhessea vaginae, Mycoplasma hominis, Prevotella bivia, Mobiluncus spp., entre outras. Essa condição, quando sintomática, pode causar corrimento e mau odor, além de estar associada à maior vulnerabilidade às ISTs e a complicações gestacionais. Uma das principais espécies bacterianas associadas à VB é a G. vaginalis, historicamente considerada a principal espécie envolvida na etiologia dessa disbiose. Trata-se de uma espécie produtora de sialidase A e vaginolisina como fatores de virulência, sendo que ambos permitem a formação do biofilme. F. vaginae é outra espécie bacteriana frequente no core patológico da VB e que geralmente está em combinação com G. vaginalis, possuindo importante papel na formação e no estabelecimento do biofilme. A microbiota vaginal atua na modulação imunológica do microambiente vaginal. A VB é clinicamente considerada uma condição não inflamatória; apesar disso, está associada a uma inflamação molecular, caracterizada pela produção de citocinas pró-inflamatórias. Comunidades dominadas por espécies anaeróbias estão associadas a uma resposta pró-inflamatória mais intensa em comparação àquelas dominadas por Lactobacillus spp. A coocorrência de G. vaginalis e F. vaginae no biofilme vaginal pode resultar em um efeito sinérgico sobre a resposta imune do hospedeiro. Diante desse cenário, estudos são necessários para determinar a coexistência de G. vaginalis e F. vaginae nas disbioses vaginais e na microbiota normal de mulheres em idade reprodutiva. Metodologia: Foi realizado um estudo prospectivo, transversal, que incluiu 152 mulheres atendidas no Ambulatório de Infecções Genitais Femininas do Complexo HCFMB, Unesp, nos anos de 2024 e 2025. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa local (CAAE 91235025.0.0000.5411). No momento da inclusão no estudo, foi realizada a coleta de conteúdo vaginal para posterior classificação da microbiota vaginal em exame microscópico corado pelo método de Gram, aplicando os critérios de Nugent et al. (1991). Foram incluídas mulheres com diagnóstico de Flora I (N = 68), Flora II (N = 24) e VB (N = 60). Foi realizada a coleta de material endocervical para pesquisa de N. gonorrhoeae, C. trachomatis, T. vaginalis e M. genitalium, bem como a coleta de lavado vaginal para a pesquisa de G. vaginalis e F. vaginae e a dosagem de citocinas. A extração do DNA das amostras endocervicais foi realizada com o kit QIAmp DNA Mini and Blood Mini Handbook (Qiagen, Hilden, NRW, Alemanha). Para a pesquisa de N. gonorrhoeae, C. trachomatis, T. vaginalis e M. genitalium, foi realizada PCR em tempo real multiplex utilizando o kit Allplex™ CT/NG/MG/TV Assay (Seegene). A extração do DNA dos lavados cervicovaginais foi realizada com o kit DNeasy PowerSoil Pro (Qiagen, Hilden, NRW, Alemanha). Para a obtenção da curva padrão de G. vaginalis, bactérias (ATCC #14018) adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC) foram cultivadas em meio New York City III e, em seguida, foi realizada uma etapa de clonagem. O DNA plasmidial obtido foi utilizado para a construção da curva padrão. A quantificação absoluta de G. vaginalis foi realizada por PCR quantitativo em tempo real (qPCR), utilizando os primers F-GV1 e RGV3. Para a obtenção da curva padrão de F. vaginae, foi utilizado um plasmídeo contendo o gene de interesse que codifica a região 16S rRNA de F. vaginae (Thermo Fisher Scientific GENEART). A quantificação absoluta de F. vaginae foi realizada por PCR quantitativo em tempo real (qPCR), utilizando os primers Fw e Rv. Para determinar a produção das citocinas inflamatórias IL-1β, IL-6, CXCL-8, IL-10 e TNF-α, foram coletados lavados cervicovaginais e utilizado o kit DuoSet, disponível comercialmente (R&D Systems, MN, EUA), seguindo as instruções do fabricante. Resultados: G. vaginalis e F. vaginae foram detectadas em 62,5% e 69,7% das amostras, respectivamente. As cargas bacterianas de G. vaginalis foram significativamente maiores no grupo VB [7,2 cópias/µL (6,1–8,7)] quando comparadas ao grupo Flora I [3,4 cópias/µL (1,8–6,7); p < 0,001]. Já as cargas bacterianas de F. vaginae foram estatisticamente maiores no grupo VB [6,5 cópias/µL (5,5–7,5)] quando comparadas aos grupos Flora I [4,4 cópias/µL (3,9–5,1); p < 0,001] e Flora II [4,5 cópias/µL (3,7–5,4); p < 0,001]. Os níveis de IL-1β foram significativamente maiores nos grupos Flora II [2,3 pg/mL (1,8–2,7); p = 0,011] e VB [2,1 pg/mL (1,6–2,5); p = 0,024] quando comparados ao grupo Flora I [1,7 pg/mL (1,3–2,3)], enquanto os níveis de CXCL-8 foram mais elevados no grupo Flora II [3,3 pg/mL (3,1–3,6)] quando comparado ao grupo Flora I [3,1 pg/mL (2,7–3,5); p = 0,021]. Não houve diferença significativa nos níveis das demais citocinas (IL-6, IL-10 e TNF-α) entre os diferentes padrões de microbiota. Conclusão: A VB está associada ao aumento das cargas de G. vaginalis e F. vaginae e ao aumento seletivo de IL-1β, evidenciando uma assinatura inflamatória distinta associada à disbiose vaginal.
Resumo (inglês)
Introduction: A healthy vaginal microbiota, predominantly composed of lactobacilli species in women of reproductive age, plays an important role in maintaining female reproductive health by providing a protective microenvironment against pathogens that cause sexually transmitted infections (STIs) and by inhibiting the growth of other bacterial species. As a dynamic environment, the vaginal microbiota may undergo changes. Imbalances in the vaginal microbiota can lead to the development of bacterial vaginosis (BV), a classical dysbiosis common among women of reproductive age, characterized by the reduction or absence of Lactobacillus spp. together with an increased abundance of facultative anaerobic bacterial species such as Gardnerella vaginalis, Fannyhessea vaginae, Mycoplasma hominis, Prevotella bivia, Mobiluncus spp., among others. When symptomatic, this condition may cause vaginal discharge and unpleasant odor, and is also associated with increased susceptibility to STIs and pregnancy-related complications. One of the main bacterial species associated with BV is G. vaginalis, historically considered the primary species involved in the etiology of this dysbiosis. This species produces sialidase A and vaginolysin as virulence factors, both of which enable biofilm formation. F. vaginae is another bacterial species frequently found in the pathological core of BV and is usually present in combination with G. vaginalis, playing an important role in biofilm formation and establishment. The vaginal microbiota also plays a role in the immunological modulation of the vaginal microenvironment. Although BV is clinically considered a non-inflammatory condition, it is associated with molecular inflammation characterized by the production of pro-inflammatory cytokines. Communities dominated by anaerobic species are associated with a more intense pro-inflammatory response compared to those dominated by Lactobacillus spp. The co-occurrence of G. vaginalis and F. vaginae in the vaginal biofilm may result in a synergistic effect on the host immune response. In this context, further studies are needed to determine the coexistence of G. vaginalis and F. vaginae in vaginal dysbiosis and in the normal microbiota of women of reproductive age. Methods: A prospective, cross-sectional study was conducted including 152 women attended at the Female Genital Infections Outpatient Clinic of the HCFMB Complex, Unesp, between 2024 and 2025. The study was approved by the local Research Ethics Committee (CAAE 91235025.0.0000.5411). At enrollment, vaginal samples were collected for microbiota classification using Gram-stained microscopic examination according to the criteria of Nugent et al. (1991). Women were classified as Normal microbiota (N = 68), Intermediate microbiota (N = 24), or BV (N = 60). Endocervical samples were collected for the detection of N. gonorrhoeae, C. trachomatis, T. vaginalis, and M. genitalium, and vaginal lavage samples were collected for the detection of G. vaginalis and F. vaginae and for cytokine quantification. DNA extraction from endocervical samples was performed using the QIAmp DNA Mini and Blood Mini Handbook kit (Qiagen, Hilden, NRW, Germany). Multiplex real-time PCR was carried out using the Allplex™ CT/NG/MG/TV Assay (Seegene) for the detection of N. gonorrhoeae, C. trachomatis, T. vaginalis, and M. genitalium. DNA extraction from cervicovaginal lavage samples was performed using the DNeasy PowerSoil Pro kit (Qiagen, Hilden, NRW, Germany). For the construction of the standard curve for G. vaginalis, bacteria (ATCC #14018) obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) were cultured in New York City III medium and subsequently subjected to a cloning step. The resulting plasmid DNA was used to generate the standard curve. Absolute quantification of G. vaginalis was performed by real-time quantitative PCR (qPCR) using the F-GV1 and RGV3 primers. For the standard curve of F. vaginae, a plasmid containing the gene encoding the 16S rRNA region of F. vaginae (Thermo Fisher Scientific GENEART) was used. Absolute quantification of F. vaginae was carried out by real-time qPCR using the Fw and Rv primers. To measure the production of inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, CXCL-8, IL-10, and TNF-α), cervicovaginal lavage samples were collected and analyzed using the commercially available DuoSet kit (R&D Systems, MN, USA), following the manufacturer’s instructions. Results: G. vaginalis and F. vaginae were detected in 62.5% and 69.7% of the samples, respectively. The bacterial loads of G. vaginalis were significantly higher in the BV group [7.2 copies/µL (6.1–8.7)] compared to the Flora I group [3.4 copies/µL (1.8–6.7); p < 0.001]. Similarly, F. vaginae loads were significantly higher in the BV group [6.5 copies/µL (5.5–7.5)] compared to both normal microbiota [4.4 copies/µL (3.9–5.1); p < 0.001] and intermediate microbiota [4.5 copies/µL (3.7–5.4); p < 0.001]. IL-1β levels were significantly higher in the intermediate microbiota [2.3 pg/mL (1.8–2.7); p = 0.011] and BV groups [2.1 pg/mL (1.6–2.5); p = 0.024] compared to the normal microbiota group [1.7 pg/mL (1.3–2.3)]. CXCL-8 levels were also higher in the intermediate microbiota group [3.3 pg/mL (3.1–3.6)] than in the normal microbiota group [3.1 pg/mL (2.7–3.5); p = 0.021]. No significant differences were observed in the levels of the other cytokines (IL-6, IL-10, and TNF-α) among the different microbiota patterns. Conclusion: BV is associated with increased loads of G. vaginalis and F. vaginae and with a selective increase in IL-1β, indicating a distinct inflammatory signature associated with vaginal dysbiosis.
Descrição
Palavras-chave
Microbiota, Vaginose bacteriana, Citocinas
Idioma
Português
Citação
SOUZA, Laura Emi Yonezawa de. Além da presença: contribuições da abundância absoluta de Gardnerella vaginalis e Fannyhessea vaginae para a resposta inflamatória vaginal. 2026. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, 2026.
