Desenvolvimento de sonda fluorescente para a determinação específica da atividade halogenante das enzimas mieloperoxidase e peroxidase de eosinófilos

Abstract

A enzima mieloperoxidase (MPO), proveniente dos neutrófilos e monócitos, é capaz de catalisar a oxidação de íons Cl- e Br- a partir da redução do peróxido de hidrogênio. Os oxidantes formados, ácido hipocloroso (HOCl) e ácido hipobromoso (HOBr) são intensamente reativos e atuam como agentes bactericidas, podendo estar envolvidos em processos deletérios que caracterizam doenças de cunho inflamatório. A determinação da atividade halogenante específica da MPO não é trivial, pois devido ao alto potencial redox da forma ativa composto I (1,16 V), além de Cl- e Br-, ela é capaz de catalisar a oxidação de vários compostos orgânicos pelo mecanismo peroxidásico. Assim, são poucas as metodologias utilizadas até o momento que medem exclusivamente a atividade halogenante. Neste trabalho desenvolvemos uma metodologia para a determinação da atividade halogenante da MPO utilizando a sonda fluorescente dansilglicina (DG), a qual se mostrou insensível a ação peroxidásica da enzima, mas susceptível ao ataque eletrofílico dos ácidos HOCl e HOBr. Os estudos de cinética rápida mostram que a velocidade de reação entre a DG e o HOCl aumenta com a adição de Br-. Foi possível verificar a queda linear na intensidade de fluorescência da DG quando concentrações crescentes de HOCl foram adicionadas ao meio reacional juntamente com uma concentração fixa de Br-. Os mesmos resultados foram obtidos utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e, quando acoplado ao espectrômetro de massas, foi possível identificar o produto da reação, o composto bromossubstituído da DG. Os estudos utilizando a enzima MPO comprovaram a especificidade da metodologia, visto que a queda de fluorescência na ausência de Cl- e Br- foi mínima. A peroxidase de eosinófilos tambem é capaz de catalisar a oxidação de haletos, produzindo principalmente o HOBr. Desta maneira, ao aplicar a metodologia da DG na determinação da atividade halogenante da EPO, a produção de HOCl/HOBr tambem pode ser analisada. Posteriormente, ao utilizar a metodologia da DG, em estudos com inibidores, foi possível distinguir o mecanismo de um inibidor reversível do mecanismo de um inibidor irreversível, em estudos realizados para a MPO e para a EPO. Concluímos que o método baseado na queda de fluorescência da DG possui grande potencial como técnica para detecção direta e específica da atividade halogenante das enzimas MPO e EPO.

The enzyme myeloperoxidase (MPO) is able to catalyze the oxidation of chloride (Cl-) and bromide (Br-) ions from the reduction of hydrogen peroxide. The formed oxidizing agents, hypochlorous acid (HOCl) and hypobromous acid (HOBr) are highly reactive and involved in deleterious inflammatory processes that characterizes many diseases. The determination of the specific halogenating activity of MPO is not trivial, because due to high redox potential of the active form of compound I (MPO-I, 1.16 V), MPO is also capable to catalyze the oxidation of various organic compounds by the peroxidase mechanism. Thus, there are few methods used to date to measure only the halogenating activity. In this work, we developed a methodology for determining the halogenating activity of MPO using the fluorescent probe dansylglycine (DG), which proved insensitive to peroxidase action, but susceptible to electrophilic attack of HOCl and HOBr. The fast kinetics studies show that the reaction rate between DG and HOCl increases with the addition of Br-. It was possible to verify a linear decrease in fluorescence intensity of DG when increasing concentrations of HOCl were added to the reaction medium together with a fixed concentration of Br-. The same results were obtained using high performance lquid chromatography (HPLC) and, when coupled to mass spectrometry, it was possible to identify the product of the reaction, the compound bromo-dansylglycine. The abstraction of Cl- and Br- from the buffer blocked totally the fluorescence decay of dansylglycine. Eosinophil peroxidase is also capable of catalyzing the oxidation of halides, mainly producing HOBr. Thus, when applying the DG methodology in the determination of the halogenating activity of EPO, the production of HOCl / HOBr was also verified. By applying the DG methodology in studies with MPO and EPO inhibitors, it was possible to distinguish the mechanism of a reversible inhibitor from an irreversible one. In conclusion, this method based on the DG fluorescence bleaching has a great potential as a direct and selective analytical technique and for detection of MPO and EPO halogenating activity.