Publicação: Estudos estruturais e calorimétricos com a Importina-α de mamífero e a sequência de localização nuclear (NLS) da MLH1, uma proteína envolvida no reparo de DNA
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Autores
Orientador
Fontes, Marcos Roberto de Mattos 
Coorientador
Pós-graduação
Curso de graduação
Física Médica - ibb
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Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Trabalho de conclusão de curso
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (inglês)
The communication between the cell nucleus and the cytoplasm happens through transport mechanisms that allow the passage of molecules through pores present in the nuclear envelope. Among the known transport pathways are the so-called Nuclear Import Classical Pathway, which proteins containing the classical nuclear localization sequences (NLSs) are imported into the nucleus by the importin-α / β heterodimer. Importin-α (Impα) contains the NLS recognition site and, importin-β (Impβ) mediates transport through the nuclear membrane pore. In the process of DNA replication, some errors may not go through the DNA polymerase verification process, so mismatches can be corrected, even if the DNA polymerase has not detected them. In humans, a heterodimer formed by the interaction of the MLH1 and PMS2 proteins, acts by coordinating the process of base mismatch repair (MMR), being essential for the maintenance of fidelity in DNA replication. This work deals with the structural and calorimetric studies of the Impα complex with NLS peptide of proteins related to DNA repair, MLH1, using crystallographic techniques and affinity tests by isothermal titration calorimetry (ITC) assays and comparison with previous studies. Expression and purification of the Mus musculus Impα truncated in its N-terminal portion was performed and the co-crystallization of Impα with a mutated NLS peptide, which was replaced the arginine (R) 472 by a lysine (K) (MLH1-R472K) of the MLH1 protein. X-ray diffraction data were collected and processed at 2.15 Å resolution. Thus, the Impα structure containing the MLH1-R472K cNLSs was elucidated. NLS peptide MLH1-R472K bound to Impα similarly to MLH1 NLS to the primary binding site (S1) of Impα, but it was not observed peptide binding at the secondary (S2) as occurred with native MLH1 NLS. The data obtained by ITC corroborated with the crystallographic data (Impα / MLH1- R472K complex) showing that there was interaction of the protein with only one peptide. These data together show that the R472K mutation was critical because the decreased affinity of the mutated peptide that would bind at the P2' position of the secondary site. In addition, it can be seen from the ITC data, a decrease in the affinity of the mutated peptide compared to the native also at the main site (S1). These data corroborate with the lower number of interactions observed in the crystallographic structure of the K472 residue compared to R472. This work, together with other related experiments that are currently performed in our the group, can generate very important data for a better understanding of the structural determinants of NLS peptide binding to the Impα
Resumo (português)
A comunicação entre o núcleo celular e o citoplasma acontece através de mecanismos de transporte que permitem a passagem de moléculas por poros presentes no envoltório nuclear. Dentre as vias de transporte conhecidas tem-se a chamada Via Clássica de Importação Nuclear, onde proteínas que contém as clássicas sequências de localização nuclear (NLSs) são importadas para o núcleo pelo heterodímero importina-α/β. A importina-α (Impα) contém o sítio de reconhecimento do NLS, enquanto a importina-β (Impβ) media o transporte através do poro da membrana nuclear. No processo de replicação do DNA, alguns erros podem não passar pelo processo de verificação da DNA polimerase, portanto erros de pareamento podem ser corrigidos, mesmo que a DNA polimerase não os tenha detectado. Em humanos um heterodímero formado pela interação das proteínas MLH1 e PMS2, atua coordenando o processo de reparo de mal-pareamento de bases (MMR), sendo essencial para a manutenção da fidelidade na replicação do DNA. Esse trabalho trata dos estudos estruturais e calorimétricos do complexo da Imp com peptídeo NLS de proteínas relacionadas ao reparo de DNA, a MLH1, utilizando técnicas de cristalografia e ensaios de afinidade pela técnica de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) e a comparação com outras estruturas já elucidadas. A expressão e purificação da Impα de M. musculus truncada em sua porção N-terminal foi realizada, bem como a co-cristalização da Imp com peptídeo NLS mutado, substituindo a arginina (R) 472 por uma lisina (K) (MLH1-R472K) da proteína MLH1. Dados de difração de raios X foram coletados e processados com 2,15 Å de resolução. Com esse resultado, a estrutura da Impα contendo a cNLSs MLH1-R472K foi elucidada. O peptídeo NLS MLH1-R472K ligou-se à Impα de maneira similar ao NLS da MLH1 no sítio de ligação principal (S1) da Impα, porém não houve ligação do peptídeo no secundário (S2) como ocorreu com a MLH1 NLS nativa. Os dados obtidos por ITC corroboraram com os dados cristalográficos (complexo Impα/MLH1- R472K) mostrando que houve a interação da proteína com apenas um peptídeo. Estes dados em conjunto mostram que a mutação R472K foi fundamental pela diminuição da afinidade do peptídeo mutado que se ligaria a posição P2` do sítio secundário. Além disso, pode-se observar pelos dados de ITC uma diminuição da afinidade do peptídeo mutado comparado ao nativo também no sítio principal. Os dados corroboram com o menor número de interações observadas na estrutura cristalográfica do resíduo K472 comparado ao R472. Este trabalho, em conjunto com outros sendo realizados pelo grupo atualmente, poderá gerar dados muito importantes para uma melhor compreensão sobre os determinantes estruturais da ligação de peptídeos NLS e a Impα
Descrição
Palavras-chave
Biofísica, Importação nuclear, Biologia estrutural
Idioma
Português
