Potencial antifúngico da associação de peptídeo antimicrobiano com inativação fotodinâmica para eliminação de candida albicans

Abstract

A resistência antifúngica por Candida albicans vem crescendo e levando à busca por tratamentos alternativos, como é o caso da inativação fotodinâmica (PDI) em associação a peptídeos antimicrobianos (PAMs). A PDI consiste na combinação de luz visível, oxigênio e uma substância fotossensibilizadora (FS) capaz de absorver luz e transferir energia ou elétrons para uma molécula de oxigênio, e assim, gerar espécies reativas de oxigênio. Já, a melitina (MEL) é um PAM encontrado no veneno da abelha Apis mellifera e apresenta efeito antiviral, antibacteriano e antifúngico. O objetivo desse estudo foi avaliar a associação do peptídeo MEL ao tratamento fotodinâmico com CUR como possível alternativa antifúngica e antibiofilme sobre cepas de C. albicans. Foi realizado um estudo experimental laboratorial. Para a avaliação da caracterização fotofísica, foi empregado um espectrofotômetro afim de se analisarem os espectros de absorção da CUR (80 à 10µM) na presença ou ausência da MEL em diferentes tempos de iluminação (0 à 30 minutos), como também foi determinado o espectro da MEL sozinha. Para avaliação da PDI, foram utilizadas uma cepa susceptível ATCC 90028 (CaS) e outra resistente ao fluconazol ATCC 96901 (CaR). Para avaliação em células planctônicas, foram utilizadas 6 concentrações de CUR e 3 de MEL e obtidas duas placas idênticas: uma para o efeito fotodinâmico (iluminação com LED por 6,5 minutos, dose de 18,3 J/cm2) e outra para o efeito sem luz (escuro por 6,5 minutos). Para o efeito antimicrobiano sobre biofilmes maduros de cada cepa, foram selecionadas 3 concentrações de CUR, 1 concentração de MEL e associação de ambos com e sem iluminação. O protocolo consistiu em 15 minutos de incubação da MEL, seguido de 5 minutos com CUR, previamente a iluminação por 6,5 min. Diluições seriadas foram obtidas para determinação das UFC/mL. Os dados foram analisados com estatística descritiva e ANOVA (dois e três fatores) e teste de comparações múltiplas de médias (α=0,05). Foi observado que em amostras planctônicas, para a CaS, após iluminação, tanto a CUR (≥10μM) como a MEL (8 e 16 μg/mL) promoveram redução nos valores de log10(UFC/mL) (p≤0,001), sem interação entre ambas (p=1,000). Sem luz, a CUR não possuiu efeito enquanto a MEL (8 e 16µg/mL; p=0,003) levou a pequena redução. Para a cepa CaR, após iluminação, houve redução nos valores log10UFC/mL, promovida pela CUR (≥6μM; p<0,0001) e MEL (62 µg/mL; p=0,025), sem interação entre ambas (p=0,946). Sem luz, o efeito da CUR, MEL e interação não foi significativo (p>0,711). No efeito antibiofilme, para a CaS a MEL não teve efeito no perfil de resposta (p=0.364). Para CaR observou-se efeito fotodinâmico com as três concentrações de CUR (p <0,0001), sem a presença da MEL. Ao associar MEL, o efeito foi atingido na concentração de 4μM de CUR (p <0,0001). Conclui-se que a associação de CUR e MEL, não possui efeito sinérgico nos biofilmes uma vez que a PDI com CUR por si só promoveu redução de viabilidade.

Antifungal resistance by Candida albicans has been increasing and leading to the search of alternative treatments, such as photodynamic inactivation (PDI) in association with antimicrobial peptides (AMPs). PDI consists of the combination of visible light, oxygen and a photosensitizing substance (PS) capable of absorbing light and transferring energy or electrons to an oxygen molecule, thus generating reactive oxygen species. Melittin (MEL) is a AMP found in the venom of the Apis mellifera bee and has antiviral, antibacterial and antifungal effects. The objective of this study was to evaluate the association of the MEL peptide with photodynamic treatment with CUR as a possible antifungal and antibiofilm alternative against C. albicans strains. An experimental laboratory study was carried out. To evaluate the photophysical characterization, a spectrophotometer was used to analyze the absorption spectra of CUR (CUR; 80 to 10 µM) in the presence or absence of MEL. Thus, the 10 µM concentration was associated with MEL (62 µg/mL) and analyzed at different illumination times (0 to 30 minutes), as well as the spectrum of MEL alone. To evaluate PDI, a susceptible strain ATCC 90028 (CaS) and another fluconazole-resistant strain ATCC 96901 (CaR) were used. For evaluation in planktonic cells, 6 concentrations of CUR and 3 of MEL were used and two identical plates were obtained: one for the photodynamic effect (LED illumination for 6.5 minutes, dose of 18.3 J/cm2) and another for the effect of CUR without light (darkness for 6.5 minutes). For the antimicrobial effect on mature biofilms of each strain, 3 concentrations of CUR, 1 concentration of MEL and a combination of both with and without illumination were selected. The protocol consisted of 15 minutes of incubation with MEL, followed by 5 minutes with CUR, prior to illumination for 6.5 min. Serial dilutions were obtained to determine CFU/mL. Data were analyzed with descriptive statistics and ANOVA (two and three factors) and multiple comparisons test of means (α=0.05). It was observed that in planktonic samples, for CaS, after illumination, both CUR (≥10μM) and MEL (8 and 16 μg/mL) promoted a reduction in log10(CFU/mL) values (p≤0.001), with no interaction between them (p=1.000). Without light, CUR had no effect, while MEL (8 and 16 µg/mL; p=0.003) led to a small reduction. For the CaR strain, after illumination, there was a reduction in log10UFC/mL values, promoted by CUR (≥6 µM; p<0.0001) and MEL (62 µg/mL; p=0.25), with no interaction between them (p=0.946). Without light, the effect of CUR, MEL and interaction was not significant (p>0.711). In the antimicrobial effect, for CaS, MEL had no effect on the response profile (p=0.364). For CaR, a photodynamic effect was observed with the three concentrations of CUR (p<0.0001), without the presence of MEL. When associating MEL, the effect was achieved at the concentration of 4 µM of CUR (p<0.0001). It is concluded that the association of CUR and MEL does not have a synergistic effect on biofilms since PDI with CUR alone promoted a reduction in viability.