Caracterização biofísica da proteína Grb2 Y160F: efeitos da mutação no equilíbrio monômero-dímero e interação com inibidores da via RAS/MAPK

Abstract

A Grb2 (do inglês, Growth factor receptor bound 2) é uma proteína adaptadora que se destaca por participar de diversas vias de sinalização e por ser essencial para a formação e manutenção da vida. Dentre todas as suas funções, seu mecanismo de regulação da via RAS/MAPK através de um equilíbrio monômero-dímero, em que o monômero atua em complexos iniciais de sinalização como uma ponte entre um receptor tirosina quinase (RTK) ativo e a proteína RAS através do complexo RTK-GRB2-SOS-RAS; e o dímero é a forma auto-inibida da proteína. Mesmo com o equilíbrio monômero-dímero sendo um dos mecanismos mais bem caracterizados para a Grb2, ainda são pouco conhecidos os fatores que promovem a dissociação do dímero, e a literatura referente ao monômero é escassa devido à baixa constante de dissociação in vitro da Grb2, estimada em aproximadamente 0,8 µM. A mutação Y160F de Grb2 já havia sido descrita na literatura, mas em estudos que foram realizados antes da identificação da importância do resíduo Y160 na dissociação do dímero. Ao revisitarmos esses estudos com o conhecimento atual sobre Grb2, identificamos um possível equilíbrio monômero-dímero para a Grb2 Y160F, mesmo com essa mutação rompendo a principal ligação química da interface de dimerização canônica. Neste estudo, caracterizamos o comportamento da Grb2 Y160F em solução, identificamos uma nova interface de dimerização e avaliamos o monômero quanto à sua estabilidade e viabilidade para estudos estruturais e funcionais. Nossos resultados também contribuem para o desenvolvimento futuro de inibidores específicos da via RAS/MAPK, com potencial terapêutico.

The Grb2 (Growth factor receptor bound 2) protein is an adaptor known for its involvement in multiple signaling pathways and its essential role in the formation and maintenance of life. Among its various functions, one of the most well-characterized mechanisms is its regulation of the RAS/MAPK pathway through a monomer-dimer equilibrium. In this process, the monomer acts in early signaling complexes as a bridge between an active receptor tyrosine kinase (RTK) and the RAS protein, forming the RTK-GRB2-SOS-RAS complex, while the dimer represents the auto-inhibited form of the protein. Although the monomer-dimer equilibrium is well established, the factors that promote dimer dissociation remain poorly understood, and the literature on the monomer is limited due to Grb2’s low in vitro dissociation constant, estimated at approximately 0.8 µM. The Y160F mutation in Grb2 had been previously described, but in studies conducted before the identification of the importance of the Y160 residue in dimer dissociation. Upon revisiting these studies with current knowledge, we identified a possible monomer-dimer equilibrium for Grb2 Y160F, despite this mutation disrupting the main chemical bond in the canonical dimerization interface. In this study, we characterized the behavior of Grb2 Y160F in solution, identified a new dimerization interface, and evaluated the monomer in terms of its stability and suitability for structural and functional studies. Our findings also contribute to the future development of specific inhibitors of the RAS/MAPK pathway with therapeutic potential.