Detecção de variantes germinativas no plasma de cadelas com neoplasias mamárias por sequenciamento de nova geração

Abstract

O câncer de mama é uma das neoplasias malignas mais incidentes em mulheres e cadelas. Em mulheres, sabe-se que mutações patogênicas herdadas nos genes de alta penetrância podem estar associadas ao risco elevado da doença, à resistência a terapias e ao prognóstico reservado ou ruim. Em cadelas, existem muitos dados divergentes sobre o envolvimento dos genes de alta penetrância (BRCA1 e BRCA2) com a carcinogênese mamária e sobre a verdadeira patogenicidade das variantes detectadas. Dessa forma, o objetivo principal deste estudo foi detectar variantes germinativas nos genes de alta e moderada penetrância associados ao câncer de mama em mulheres no plasma de cadelas por meio do sequenciamento de nova geração (NGS). Para tanto, foram coletadas vinte amostras de sangue provenientes de dez cadelas recém diagnosticadas com neoplasias de glândula mamária (RD), cinco cadelas mastectomizadas (MAST) e cinco cadelas sem neoplasia (CTR). Posteriormente, foram realizadas as etapas de extração do DNA livre circulante (plasmático), construção da biblioteca utilizando um painel de genes específicos associados ao câncer de mama em mulheres, incluindo os genes BRCA1, BRCA2, CDH1, STK11, TP53, PALB2 e ATM, e, por fim, análise bioinformática para detecção de variantes: polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), deleções e inserções (indels). Foram detectadas 218 variantes no total, sendo 32,56% (n=71) em regiões codificantes e 13,76% (n=30) classificadas como de moderado impacto, a maioria do tipo missense. Dentre os genes de alta penetrância, o gene BRCA2 foi o que mais apresentou variantes, sendo identificados onze SNPs e dois indels, dessas, destacaram-se p.Thr1425Pro e p.Leu2307del, que foram classificadas como possivelmente patogênicas pelos programas de predição in silico. Em relação aos genes de moderada penetrância, foi identificado um quantitativo menor de variantes, quando comparados aos genes de alta penetrância e, dentre os genes avaliados, o PALB2 merece evidência, pois foram detectadas duas novas variantes possivelmente patogênicas: p.Ala949Val e p.Pro590_Val595delinsLeu. Assim, o sequenciamento de nova geração permitiu identificar grande quantidade de variantes, ainda de significado incerto, nos genes de predisposição ao câncer de mama, e essa condição parece ser semelhante em mulheres. São necessários estudos adicionais para validar as variantes identificadas em cadelas com câncer de mama para que, futuramente, seja possível proporcionar tratamento personalizado às pacientes.

Breast cancer is one of the most common malignant tumors in women and dogs. In women, pathogenic mutations inherited in high penetration genes are associated with increased risk of the disease, resistance to therapies and poorer prognosis. In dogs, there are many divergent data involving high penetration genes (BRCA1 and BRCA2) role in breast carcinogenesis and on true pathogenicity of the detected variants. Therefore, the main objective of this study was to detect germline variants in the genes of high and moderate penetrance associated with breast cancer in women in female dogs plasma using next generation sequencing (NGS). Blood from 20 female dogs were sampled: 10 newly diagnosed with mammary gland neoplasms (ND), 5 mastectomized (MAST) and 5 without neoplasm (CTR). Subsequently, the steps for extracting free circulating (plasmatic) DNA were performed, building the library using a panel of specific genes associated with breast cancer in women, including the genes BRCA1, BRCA2,CDH1, STK11, TP53, PALB2 and ATM, and, at last, bioinformatics analysis for variant detection: single nucleotide polymorphisms (SNPs), and deletions and insertions (indels). 218 variants were detected, 32.56% (n=71) in coding regions, and 13.76% (n = 30) classified as moderate impact, mostly the missense type. Among the high penetration genes, the BRCA2 gene was the one with the most variants – 11 SNPs and 2 indels being identified – and the variants p.Thr1425Pro and p. Leu2307del stand out, being classified as possibly pathogenic by in silico prediction programs. Regarding the genes of moderate penetrance, a smaller number of variants were identified when compared to the genes of high penetrance, and, among the evaluated genes, PALB2 deserves attention, as 2 new possibly pathogenic variants were detected: p.Ala949Val and p.Pro590_Val595delinsLeu. Thus, new generation sequencing allowed the identification of a large number of variants, still of uncertain significance, in the breast cancer predisposition genes and this condition appears to be similar in women. Additional studies are needed to validate the identified variants in female dogs patients with breast cancer in order to provide them with personalized treatment in the future.