Estudo de indução de apoptose por Paracoccidioides brasiliensis durante a interação com células epiteliais e efeitos antiapoptóticos de substâncias naturais

Abstract

Apoptosis is an important mechanism of cell regulation and several pathogens can modulate it, establishing the host infection. It was demonstrated in P. brasiliensis (Pb) and it occurs as a result of its internalization in epithelial cells, resulting in evasion of the immune response. Thus, this study aimed to evaluate the Pb behavior by analyzing some of its virulence factors involved in the induction of apoptosis using the model of interaction with epithelial cells, and verifying the anti-apoptotic activity of natural substances, such as maitenin and alkyl gallates, in order to identify interesting targets for antifungal research. For this purpose, it was used the strain 18 of Pb, and the previously purified adhesins (43kDa glycoprotein and 14-3-3 protein). The natural substances maitenin, decyl gallate (G14), and undecyl gallate (G15) were tested, as well as the amphotericin B and itraconazole used as controls. Assessment of apoptosis induction by different virulence factors of Pb in epithelial cells and anti-apoptotic effect of selected compounds was performed by TUNEL assay (Terminal deoxy-transferase mediated X-dUTP Nick End Labeling), flow cytometry analysis by evaluating the markers: Bak, Bax and Bcl-2 and confirmed by qRT-PCR for the same markers. Therefore, the expression of these markers was evaluated in the epithelial cells exposed to Pb adhesins (protein 14-3-3 and gp43), which were treated or not with maitenin, G14 and G15. The results showed decreased expression of pro-apoptotic markers after treatment with G14, indicating that this substance could be used as an apoptosis inhibitor, and it could help in the control of fungal infections

Apoptose é um importante meio de regulação das células e vários patógenos podem modulá-la estabelecendo a infecção no hospedeiro. Em P. brasiliensis (Pb) já foi demonstrada e ocorre como consequência de sua internalização em células epiteliais podendo culminar na evasão da resposta imune. Dessa forma, este trabalho teve por objetivo avaliar o comportamento de Pb, através da verificação de alguns de seus fatores de virulência em induzir apoptose no modelo de interação com células epiteliais e verificar a atividade antiapoptótica das substâncias naturais maitenina e galatos de alquila para a identificação de alvos interessantes na pesquisa de antifúngicos. Para tanto, utilizou-se o isolado 18 de Pb e as adesinas previamente purificadas (glicoproteína de 43kDa e proteína 14-3-3). Foram testadas as substâncias maitenina, galato de decila (G14) e galato de undecila (G15), além dos controles anfotericina B e itraconazol. A avaliação da capacidade de indução de apoptose pelos diferentes fatores de virulência de Pb em células epiteliais e o efeito anti-apoptótico das substâncias selecionadas foi realizada por TUNEL (Terminal deoxy-transferase mediated XdUTP Nick End Labeling), por citometria de fluxo através da avaliação de Bak, Bax e Bcl-2 e confirmação através de qRT-PCR para os mesmos marcadores. Para isto, a expressão desses marcadores foi avaliada em células epiteliais que foram expostas às adesinas de Pb (gp43 e proteína 14-3-3) as quais receberam ou não tratamento prévio com maitenina, G14 e G15. Os resultados demonstraram diminuição da expressão dos marcadores pró-apoptóticos quando foi realizado o tratamento prévio com G14, indicando que esta substância poderia ser utilizada como um inibidor de apoptose e dessa maneira poderia auxiliar no controle de infecções fúngicas