Efeito da administração de anticoagulantes sobre a recuperação embrionária de éguas superovuladas

Abstract

A superovulação é uma biotécnica utilizada nos programas de transferência de embrião e proporciona diversos benefícios devido ao maior número de ovulações por ciclo. Entretanto, os protocolos superovulatórios na espécie equina ainda não são utilizados rotineiramente, pois apresentam resultados inconsistentes relacionados a baixa taxa de recuperação embrionária frente ao número de ovulações, estando muito aquém do esperado quando comparado a espécie bovina. Atualmente, sabe-se que uma das possíveis causas responsáveis por este fato pode estar relacionada pela formação de grandes coágulos de sangue obstruindo a fossa da ovulação, dificultando assim a captação do oócito para o interior da tuba uterina. Desta forma, o objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da utilização de dois tipos de anticoagulantes parenterais (heparina não fracionada - HNF e heparina de baixo peso molecular - HBPM) em éguas superovuladas com extrato de pituitária equina (EPE), sobre a posterior taxa de recuperação embrionária. Foram utilizados quatro ciclos estrais de 11 éguas, sendo subdivididos em quatro grupos: Grupo 1 (G1) utilizado como controle; Grupo 2 (G2) receberam 25 mg de EPE intramuscular (IM) a cada 12 horas sendo a primeira e a terceira administração associada a 5 mg de dinoprost-trometamina (IM) e solução fisiológica 0,9% única aplicação 35 horas após indução da ovulação; Grupo 3 (G3) foi utilizado mesmo protocolo superovulatório, sendo substituído a solução fisiológica por um dos anticoagulantes, Heparina Sódica 450 UI/Kg/IV, e Grupo 4 (G4) onde as éguas foram superovuladas pelo mesmo protocolo mencionada acima e receberam 1 mg/Kg/IV de Enoxaparina Sódica. Os animais foram aleatoriamente designados aos quatros grupos em cross-over design, nos quais todos foram submetidos a todos os tratamentos. O intervalo de um ciclo estral para cada égua foi utilizado entre os tratamentos. Os tratamentos foram iniciados no sétimo dia pós-ovulação. A duração do tratamento com EPE não excedeu oito dias, sendo interrompido quando a maioria dos folículos atingissem diâmetro adequado para indução da ovulação. A indução da ovulação foi realizada utilizando 1 ml (250μg) de GnRH (Histrelina Acetato) intramuscular e 2500 UI de hCG (Gonadotrofina Coriônica Humana) intravenoso quando o(s) folículo(s) atingisse um diâmetro médio entre eles de 35 mm em ambos os grupos. A partir da indução da ovulação, 24 horas após as éguas foram inseminadas com sêmen a fresco de um garanhão de fertilidade comprovada. A colheita de embriões foi realizada no nono dia após a primeira ovulação detectada. Para cada animal submetido ao tratamento com anticoagulante foram realizadas avaliações laboratoriais (hemograma e coagulograma). Para isso foram padronizados os seguintes momentos de avaliação; para hemograma as amostras de sangue foram coletadas nos momentos prévio a administração do anticoagulante (T0 hora) servindo como controle, e três horas após a aplicação do anticoagulante (T3 horas), já para o coagulograma as amostras foram coletadas nos momentos T0, T1, T2, T3, T6, T9 e T12 horas após aplicação do anticoagulante. Os resultados demostraram maior (p<0,05) número de ovulações nos grupos de éguas superovuladas (G2 – 4,6±0,4; G3 – 5,2±0,5; G4 – 4,9±0,6) em relação ao G1 (1±0). Já o número de embriões recuperados por égua não diferiu (p>0,05) entre o G1 (0,6±0,2) e G2 (1,6±0,5), no entanto, foi maior para os grupos que receberam anticoagulantes G3 (2,5±0,3) e G4 (2,6±0,6) em relação ao G1. Quando a taxa xiii de recuperação embrionária por folículo ovulado foi avaliado, os resultados demostraram que os grupos tratados com anticoagulantes apresentaram taxas similares (G3 – 50%; G4 – 52%) em comparação ao grupo controle (G1 – 64%), já o grupo superovulado controle (G2 – 36%) apresentou tendência de redução (P = 0,8) em relação ao G1. Em relação a avaliação laboratorial, os valores hematológicos dos animais em ambos os grupos que receberam anticoagulante (G3 e G4) no momento T3 horas não diferiu (p>0,05) em relação ao momento T0 hora, mantendo-se dentro dos valores de referência. Quanto ao coagulograma, para o G3 os valores de tempo de tromboplastina parcial ativado (TTPA) a partir de uma hora após aplicação (T1 hora) apresentou aumento significativo se manteve até doze horas após aplicação (T12 horas), onde todos os momentos diferiram-se (p<0,05) em relação ao momento (T0 hora), já para o tempo de protrombina (TP) houve um aumento (p<0,05) após aplicação do anticoagulante (T1-T2 horas) em relação ao tempo de avaliação pré aplicação (T0 hora), reduzindo-se gradativamente a partir de três horas até doze horas após aplicação (T3-T12 horas), não diferindo (p>0,05) em relação do T0 hora. Para o G4, uma hora após a aplicação (T1 hora) houve um aumento (p<0,05) da atividade plasmática fator anti-Xa, apresentando um constante declínio até doze horas (T12), não apresentando diferença (p>0,05) apenas neste momento em relação ao T9 horas e T0 hora. Desta forma, pode-se concluir que o protocolo proposto no presente estudo é uma alternativa para melhoria das taxas de recuperação embrionária em éguas superovuladas com EPE, mostrando-se seguro para o uso de ambos os tipos de anticoagulantes sem apresentar alterações hematológicas ou efeitos adversos que possam comprometer ou colocar em risco a condição clínica do animal.

Superovulation is a biotechnic from embryo transfer programs providing several benefits due to the higher number of ovulations per cycle. However, superovulation protocols in the equine species are not yet routinely used, as they present inconsistent results related to the low embryonic recovery rate concerning the number of ovulations, being far below expectations when compared to the bovine species. Currently, one of the possible causes responsible for this fact may be related to the development of large blood clots obstructing the ovulation fossa, making it difficult to capture the oocyte into the fallopian tube. Therefore, this study aimed to evaluate the effect of two types of parenteral anticoagulants (unfractionated heparin - HNF and low molecular weight heparin - LMWH) on equine pituitary extract (EPE) superovulated mares of embryonic recovery. Four estrous cycles of 11 mares were used and subdivided into four groups: Group 1 (G1) as a control; Group 2 (G2) received 25 mg intramuscular EPE (MI) every 12 hours being the first and third administration associated with 5 mg dinoprost-tromethamine (IM) and 0.9% saline only application 35 hours after ovulation induction; Group 3 (G3) in the same superovulation protocol, replacing the physiological solution with one of the anticoagulants, Sodium Heparin 450 IU / kg / IV, and Group 4 (G4) where the mares were superovulated by the same protocol mentioned above and received 1 mg. / Kg / IV of Enoxaparin Sodium. All animals were randomly assigned to the four cross-over design groups, in which all underwent all treatments. The interval of one estrous cycle for each mare was used between treatments. Treatments started on the seventh day after ovulation. EPE treatment did not exceed eight days being interrupted when most follicles reached the appropriate diameter for ovulation induction. Ovulation induction was performed using 1 ml (250µg) of intramuscular GnRH (Histrelin Acetate) and 2500 IU of intravenous hCG (Human Chorionic Gonadotropin) when the follicle (s) reached a mean diameter of 35 mm in both groups. Twenty-four hours afterward ovulation induction the mares were inseminated with fresh semen from a proven fertility stallion. Embryo collection was performed on the ninth day after the first ovulation detected. Each animal at anticoagulant treatment was submitted to laboratory evaluations (blood count and coagulogram). For blood count blood samples were collected before anticoagulant administration (T0 hour) serving as a control, and three hours after applying anticoagulant (T3 hours), while for the coagulogram the samples were collected at T0, T1, T2, T3, T6, T9 and T12 hours after anticoagulant application. Groups of superovulated mares showed higher (p <0.05) number of ovulations (G2 - 4.6 ± 0.4; G3 - 5.2 ± 0.5; G4 - 4.9 ± 0.6) in relation to G1 (1 ± 0). The number of embryos recovered by mare did not differ (p> 0.05) between G1 (0.6 ± 0.2) and G2 (1.6 ± 0.5), however, it was higher for the groups that received anticoagulants G3 (2.5 ± 0.3) and G4 (2.6 ± 0.6) concerning G1. Evaluating the embryo recovery rate by ovulated follicle, anticoagulant-treated groups had similar rates (G3 - 50%; G4 - 52%) compared to the control group (G1 - 64%). Superovulated control (G2 - 36%) showed a tendency to decrease (P = 0.8) concerning G1. Hematological values in both groups receiving anticoagulant (G3 and G4) at T3 hours did not differ (p> 0.05) from T0 hour, remaining the reference values. As for the coagulogram, for G3 the activated partial thromboplastin time (TTPA) values from one hour after application (T1 hour) showed a significant increase until twelve hours after application (T12 hours), where all moments differed (p <0.05) to (T0 hour). Prothrombin time (PT) had an increase (p <0.05) after anticoagulant application (T1-T2 hours) about pre-application evaluation (T0 hour), gradually decreasing from three hours to twelve hours after application (T3-T12 hours), not differing (p> 0.05) from T0 hour. For G4, one hour after application (T1 hour) there was an increase (p <0.05) of anti-Xa factor plasma activity, showing a constant decline up to twelve hours (T12), with no difference (p> 0, 05) only at this moment in relation to T9 hours and T0 hour. The protocol proposed in this study is an alternative for improving embryo recovery rates in EPE superovulated mares, proving safe use of both types of anticoagulants without presenting hematological alterations or adverse effects compromising or endangering the clinical condition of the animal.