Padronização de extrações proteicas para estudo proteômico de células endoteliais de veia umbilical humana

Abstract

A pré-eclâmpsia (PE) é uma doença específica da gestação humana e uma das principais responsáveis pela morbimortalidade materna e perinatal. Sabe-se que a fisiopatologia da PE está relacionada à invasão trofoblástica incompleta nas artérias espiraladas seguida de hipoperfusão e isquemia placentárias. Como consequência, o organismo da gestante desenvolve um estado de estresse oxidativo com disfunção endotelial generalizada. Esta disfunção do endotélio é um fenótipo comum na PE e é definida pelo desequilíbrio entre produção endotelial dos agentes vasodilatadores e dos vasoconstritores, redução do fluxo sanguíneo para os órgãos, ativação plaquetária e inflamação vascular. A proteômica é uma ciência que descreve o conjunto de proteínas de células, tecidos, órgãos ou organismos, de modo a possibilitar um estudo aprofundado das patologias humanas, incluindo suas bases moleculares, fisiopatologia, prognóstico e biomarcadores para diagnóstico e tratamento, como demonstrado por estudos anteriores. Entretanto, um obstáculo para a extração adequada de proteínas das células para proteômica é a escolha de um tampão e de um método mecânico apropriados para extrair determinadas proteínas da célula e eliminar moléculas indesejadas, mas que não inative e degrade proteínas lábeis por calor ou oxidação. Nesse sentido, evidencia-se a importância da proteômica no estudo de uma síndrome complexa como a PE. Para isso, analisamos o conteúdo proteico das células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs) por meio de quantificação, eletroforese e espectrometria de massas, testando diferentes métodos químicos e físicos de extração. Os dados alcançados indicaram que o tampão contendo o detergente nãoiônico n-octyl-ꞵ-D-glucopyranoside associado ao processo de homogeneização por vórtex extraiu uma maior quantidade e diversidade de proteínas das HUVECs. A espectrometria de massas evidenciou que essas proteínas eram, principalmente, proteínas de ligação, estruturais ou com atividade catalítica, associadas a atividades fisiológicas. Os resultados obtidos por essa padronização permitiram identificar o conteúdo proteico das HUVECs. Ademais, os resultados poderão contribuir para pesquisas futuras relacionadas à descoberta de potenciais novos alvos farmacológicos e novos fármacos capazes de reduzir a disfunção endotelial em pacientes diagnosticadas com PE, além de auxiliar novas análises proteômicas aperfeiçoadas do extrato proteico proveniente de HUVECs.

Preeclampsia (PE) is a disease specific to human pregnancy and a major cause to maternal and perinatal morbidity and mortality. It is known that the pathophysiology of PE is related to incomplete trophoblastic invasion into the spiral arteries followed by placental hypoperfusion and ischemia. Consequently, the pregnant woman’s organism develops a state of oxidative stress and generalized endothelial dysfunction. This endothelial dysfunction is a typical phenotype in PE and is defined by the imbalance between endothelial production of vasodilator and vasoconstrictor agents, reduced blood flow to the organs, platelet activation, and vascular inflammation. Proteomics is a science that describes the set of proteins from cells, tissues, organs, or organisms to enable an in-depth study of human pathologies, including their molecular basis, pathophysiology, prognosis, and biomarkers for diagnosis and treatment, as demonstrated by previous studies. However, an obstacle to the proper extraction of proteins from cells is the choice of an appropriate buffer and mechanical methods to extract certain proteins from the cell and eliminate unwanted molecules, but without inactivation and degradation of labile proteins by heat or oxidation. In this sense, the importance of proteomic study in a complex syndrome such as PE becomes evident. To this end, we analyzed the protein content of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) by quantification, electrophoresis, and mass spectrometry, testing different chemical and physical extraction methods. The achieved data indicated that the buffer with non-ionic detergent n-octyl-ꞵ-D-glucopyranoside associated with the vortex homogenization process extracted a greater amount and diversity of proteins from HUVECs. Mass spectrometry revealed that these proteins were mainly binding proteins, structural proteins or with catalytic activity, associated with physiological activities. The results obtained by this standardization allowed the identification of the protein content of HUVECs. Furthermore, the results may contribute to future research related to the discovery of potential new pharmacological targets and new drugs capable of reducing endothelial dysfunction in patients diagnosed with PE, as well as aiding further improved proteomic analyses of the protein extract from HUVECs