Transdiferenciação de células-tronco mesenquimais equinas em células Schwann-like: Caracterização celular, análise proteômica e estabilidade fenotípica

As células de Schwann desempenham papel essencial na regeneração do sistema nervoso periférico (SNP) após lesões. Entretanto seu uso clínico é limitado, pois sua obtenção exige o sacrifício de um nervo funcional e um tempo prolongado para expansão in vitro. Como alternativa, células tronco mesenquimais (CTM) vêm sendo utilizadas como fonte para gerar células Schwann-like (CSL) por meio de diversos protocolos de transdiferenciação in vitro. Uma das abordagens mais promissoras consiste na exposição das CTM ao meio condicionado (MC) formado após o cultivo de explantes de nervos periféricos. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial de transdiferenciação in vitro de CTM equinas derivadas do cordão umbilical (CTM-CU; n=3; P3–P5) e do tecido adiposo (CTM-TA; n=4; P3–P4) em CSL, utilizando MC obtido de explantes de nervos faciais de equinos. Além disso, buscou-se caracterizar o perfil proteômico dos MCs e investigar a manutenção do fenótipo glial após a retirada do estímulo. Para a obtenção do MC utilizado para transdiferenciação das CTM-CU, foi coletado o nervo facial de um equino de três anos; para as CTM-TA, de um equino de quatro anos. Os nervos foram fragmentados e incubados por 48 horas em meio de cultura completo contendo DMEM/F12, 10% soro fetal bovino, 1% penicilina/estreptomicina e 1% de anfotericina B. Após esse período, o meio foi filtrado e utilizado para realizar a transdiferenciação das CTM em CSL durante cinco dias. As CTM indiferenciadas foram mantidas em meio padrão, enquanto as diferenciadas foram cultivadas em MC. A análise proteômica por espectrometria de massas identificou 130 proteínas exclusivas no MC utilizado com as CTM-CU e 54 proteínas exclusivas no MC aplicado às CTM-TA, incluindo periferina, neurofilamento, proteína 2 da mielina periférica (PMP2), proteínas de choque térmico e galectinas. Após o período de indução, ambas as fontes celulares apresentaram alterações morfológicas compatíveis com o fenótipo glial, como núcleos grandes e citoplasma alongado. A transdiferenciação não comprometeu a viabilidade celular, atividade metabólica, nem induziu senescência (atividade da β-galactosidase). Nas CTM-CU diferenciadas houve aumento significativo na expressão do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), do fator neurotrófico derivado da glia (GDNF), do fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF-2) e dos marcadores gliais proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína básica da mielina (MBP), proteína de ligação ao cálcio S100 beta (S100β) e receptor de neurotrofinas p75 (p75), sem alterações significativas na expressão do fator de crescimento do nervo (NGF), de Sprouty RTK Signaling Antagonist 2 (SPRY2) e do microRNA-21 (miR-21-5p). Já nas CTM-TA diferenciadas foi observado aumento significativo na expressão gênica de BDNF, GDNF e dos marcadores gliais GFAP, MBP, S100β e p75. As expressões de NGF e FGF-2 permaneceram estáveis, enquanto houve redução de SPRY2 e miR-21-5p. A imunofluorescência revelou a expressão de GFAP tanto nas células indiferenciadas quanto nas diferenciadas, enquanto S100 foi detectada apenas nas CTM diferenciadas em ambas as fontes celulares. Após a retirada do MC por 72 horas, não foram observadas alterações morfológicas em nenhuma das fontes. No entanto, nas CTM-CU houve redução significativa na expressão gênica de NGF, FGF-2 e miR-21-5p, ausência de MBP em todas as amostras e ausência da expressão de GFAP em uma das amostras. Já nas CTM-TA foi observado redução significativa na expressão gênica de GFAP e SPRY2, com aumento de GDNF e miR-21-5p. Em ambas as fontes celulares, a imunofluorescência demonstrou a persistência da expressão dos marcadores gliais GFAP e S100 após a retirada do MC. Esses achados indicam que tanto as CTM-CU quanto as CTM-TA equinas apresentam potencial de transdiferenciação em CSL mediante exposição ao MC derivado de explantes de nervo facial equino. Além disso, ambas as fontes mantiveram o fenótipo glial após a retirada dos estímulos presentes no MC. A caracterização proteômica dos MCs também forneceu informações relevantes sobre possíveis proteínas envolvidas no processo de transdiferenciação das CTM em CSL.

Resumo (inglês)

Schwann cells play an essential role in the regeneration of the peripheral nervous system (PNS) after injuries. However, their clinical use is limited, as their obtaining requires the sacrifice of a functional nerve and a prolonged time for in vitro expansion. As an alternative, mesenchymal stem cells (MSCs) have been used as a source to generate Schwann-like cells (SLCs) through various in vitro transdifferentiation protocols. One of the most promising approaches consists of exposing MSCs to conditioned medium (CM) formed after the culture of peripheral nerve explants. Thus, the objective of this study was to evaluate the in vitro transdifferentiation potential of equine MSCs derived from umbilical cord (UC-MSCs; n=3; P3–P5) and adipose tissue (AT-MSCs; n=4; P3–P4) into SLCs, using CM obtained from equine facial nerve explants. In addition, it was sought to characterize the proteomic profile of the CMs and to investigate the maintenance of the glial phenotype after stimulus withdrawal. For obtaining the CM used for transdifferentiation of UC-MSCs, the facial nerve of a three-year-old equine was collected; for AT-MSCs, of a four-year-old equine. The nerves were fragmented and incubated for 48 hours in complete culture medium containing DMEM/F12, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin and 1% amphotericin B. After this period, the medium was filtered and used to perform the transdifferentiation of MSCs into SLCs for five days. Undifferentiated MSCs were maintained in standard medium, while differentiated MSCs were cultured in CM. Proteomic analysis by mass spectrometry identified 130 exclusive proteins in the CM used with UC-MSCs and 54 exclusive proteins in the CM applied to AT-MSCs, including peripherin, neurofilament, peripheral myelin protein 2 (PMP2), heat shock proteins and galectins. After the induction period, both cell sources presented morphological changes compatible with the glial phenotype, such as large nuclei and elongated cytoplasm. Transdifferentiation did not compromise cell viability, metabolic activity, nor induce senescence (β-galactosidase activity). In differentiated UC-MSCs there was a significant increase in the expression of brainderived neurotrophic factor (BDNF), glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), fibroblast growth factor 2 (FGF-2) and glial markers glial fibrillary acidic protein (GFAP), myelin basic protein (MBP), calcium-binding protein S100 beta (S100β) and neurotrophin receptor p75 (p75), with no significant changes in the expression of nerve growth factor (NGF), Sprouty RTK Signaling Antagonist 2 (SPRY2) and microRNA-21 (miR-21-5p). In differentiated AT-MSCs, a significant increase in gene expression of BDNF, GDNF and the glial markers GFAP, MBP, S100β and p75 was observed. The expressions of NGF and FGF-2 remained stable, while there was a reduction of SPRY2 and miR-21-5p. Immunofluorescence revealed the expression of GFAP both in undifferentiated and differentiated cells, while S100 was detected only in differentiated MSCs in both cell sources. After CM withdrawal for 72 hours, no morphological changes were observed in any of the sources. However, in UC-MSCs there was a significant reduction in gene expression of NGF, FGF-2 and miR-21-5p, absence of MBP in all samples and absence of GFAP expression in one of the samples. In AT-MSCs, a significant reduction in gene expression of GFAP and SPRY2 was observed, with an increase of GDNF and miR-21-5p. In both cell sources, immunofluorescence demonstrated the persistence of the expression of glial markers GFAP and S100 after CM withdrawal. These findings indicate that both equine UC-MSCs and AT-MSCs present transdifferentiation potential into SLCs upon exposure to CM derived from equine facial nerve explants. In addition, both sources maintained the glial phenotype after the withdrawal of the stimuli present in the CM. The proteomic characterization of the CMs also provided relevant information about possible proteins involved in the process of MSC transdifferentiation into SLCs.

Palavras-chave

Cavalo, Fatores neurotróficos, Lesão de nervo periférico, Nervo facial, Regeneração nervosa, Equinos

Idioma

Português

Citação

FERREIRA, Lucas Vinícius de Oliveira. Transdiferenciação de células-tronco mesenquimais equinas em células Schwann-like: Caracterização celular, análise proteômica e estabilidade fenotípica. 2026. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, 2026.