Estudos moleculares e de interação com Cumarina (1,2-Benzopirona) da proteína Grb2 e seus mutantes Grb2 W121A e Grb2 W60A

Abstract

O desenvolvimento do câncer envolve uma série de alterações genéticas e epigenéticas que permitem o escape do controle homeostático das células, suprimindo inapropriadamente a proliferação e inibição da sobrevivência de células. Uma das alterações é a elevação do pH intracelular por volta de 7.0 para 8.0. A proteína adaptadora Grb2 está largamente envolvida em uma variedade de carcinomas devido ao seu papel crucial em vias de sinalização responsáveis pelo crescimento e proliferação celular. Propõe-se, então, neste estudo caracterizar possíveis mudanças conformacionais e dinâmicas da proteína Grb2 WT relacionada à modificação do pH e a importância dos triptofanos 60 e 121 localizados no domínio SH2 através de mutações pontuais por alanina. As proteínas Grb2 WT e W60A apresentaram estrutura predominante em dímero, enquanto W121A apresenta uma prevalência da estrutura monomérica. As estruturas diméricas apresentam um aumento do diâmetro hidrodinâmico dependentes do aumento do pH. Para Grb2 WT, este aumento do diâmetro acompanha um aumento de estruturas desordenadas, conferindo uma maior flexibilidade para a proteína. No caso de Grb2 W60A, observou-se um aumento de hélices ɑ e folhas β, sendo que a primeira ocupa um volume maior do que a segunda, corroborando com os dados de DLS, e conferindo maior estabilidade para o pH 8.0. O monômero de Grb2 com a mutação W121A, ainda não relatado na literatura, apresenta um diâmetro estável com variação de 0.1 nm entre os pHs e sem alteração significativa de sua estrutura secundária dependente do aumento de pH. A molécula de Cumarina tem recebido muita atenção na última década devido às suas propriedades anticancerígenas, embora faltem estudos à nível molecular. Um estudo conduzido por Sanches et al. (2019) caracterizou a interação com a proteína Grb2 em pH 8.0 através da técnica de Espectroscopia de Fluorescência com excitação em 290 nm, a qual pode apresentar contribuições significativas da excitação de Tirosinas. Desta forma, optou-se pela caracterização da interação entre as moléculas e as estruturas diméricas WT e W60A em ambos os pHs com excitação em 295 nm. Ambas as interações são espontâneas e governadas por contribuições hidrofóbicas, com constante de associação na ordem de 10^4 M^-1. As constantes de Hill para ambas as proteínas demonstram uma interação com cooperatividade negativa em pH 7.0 (nH~0.7) e não cooperativa para pH 8.0 (nH~1.0). A diferença de interação entre as proteínas se caracteriza pelo fato do mecanismo de supressão em pH 7.0 ser estático para a wildtype e dinâmico para W60A. De forma geral, a semelhança entre as interações da proteína Grb2 WT e Grb2 W60A indica que a cumarina apresenta sítio de interação próximo ao triptofano 121, como proposto por Sanches et al. (2019) através de análises computacionais. Quanto à estrutura secundária das proteínas, a molécula de Cumarina apresenta uma tendência de ordenação, apresentando um aumento de folhas β para a proteína Grb2 WT e de ɑ hélices para Grb2 W60A. Os resultados apresentados podem ser essenciais para o entendimento de possíveis mecanismos de restauração de sinais aberrantes em vias de sinalização provocados pela basificação do meio intracelular, além de aumentar o entendimento da interação da molécula de Cumarina e comprovar a importância do triptofano 121 no processo de dimerização da proteína Grb2 WT.

Cancer development involves a series of genetic and epigenetic alterations leading to disruption of cellular homeostasis, proliferation suppression, and survival inhibition. One of the changes is intracellular pH elevation from around 7.0 to 8.0. The adapter protein Grb2 is widely involved in various carcinomas due to its crucial role in signaling pathways responsible for cell growth and proliferation. This study aims to characterize potential conformational and dynamic changes of Grb2 WT under pH modification and the significance of tryptophans 60 and 121 located in the SH2 domain via alanine point mutations. Grb2 WT and W60A proteins exhibit predominant dimeric structure, while W121A display a prevalent monomeric structure. Dimeric structures show an increase in hydrodynamic diameter with pH increase. For Grb2 WT, this diameter increase correlates with enhanced disordered structures, imparting greater flexibility. Grb2 W60A exhibits increased ɑ-helix and β-sheet formation, particularly favoring ɑ-helix at pH 8.0, providing greater stability. The monomer of Grb2 with W121A mutation, not reported in literature, displays a stable diameter with minimal secondary structure change across pH variations. Coumarin molecule has received attention for its anticancer properties, with limited molecular-level studies. A study by Sanches et al. (2019) characterized the interaction with Grb2 protein at pH 8.0 via Fluorescence Spectroscopy with 290 nm wavelength excitation, potentially involving tyrosine excitation. Here, the interaction between the molecule and dimeric WT and W60A structures is characterized at both pHs with 295 nm excitation. Interactions are spontaneous and governed by hydrophobic contributions, with binding constants around 10^4 M^-1. Hill coefficients display negative cooperativity at pH 7.0 (nH~0.7) and non cooperative at pH 8.0 (nH~1.0). Interaction difference arises from pH 7.0 suppression mechanism being static for wildtype and dynamic for W60A. Overall, similarity in Grb2 WT and Grb2 W60A interactions suggests Coumarin’s interaction site near tryptophan 121, as proposed by Sanches et al. (2019) via computational analyses. Regarding protein secondary structures, Coumarin tends to induce ordering, increasing β-sheets for Grb2 WT and ɑ-helix for Grb2 W60A. Presented results may be key to understanding potential restoration mechanisms of aberrant signaling pathways due to intracellular alkalinization, enhancing the knowledge of coumarin interactions and confirming the importance of tryptophan 121 in the Grb2 WT protein dimerization process.