Componentes da microbiota vaginal como correlatos da infecção cervical persistente pelo papilomavírus humano (HPV) em mulheres com excisão de lesões intraepiteliais cervicais de alto grau

Introdução: O câncer do colo do útero (CCU) permanece como um dos principais problemas de saúde pública entre mulheres, especialmente em países em desenvolvimento que possuem difícil acesso ao rastreamento e à vacinação contra o Papilomavírus Humano (HPV). Dessa forma, a persistência da infecção pelo HPV de alto risco oncogênico é condição necessária, embora não suficiente, para o desenvolvimento das lesões intraepiteliais cervicais e do carcinoma invasivo. Embora a maioria das infecções pelo HPV seja transitória, fatores comportamentais, ambientais, imunológicos e microbiológicos modulam o risco não só da aquisição viral, mas sobretudo, da sua persistência. Evidências recentes demonstram que a microbiota vaginal exerce influência determinante sobre a dinâmica da infecção pelo HPV. Comunidades dominadas por Lactobacillus spp., particularmente L. crispatus, mantêm pH ácido por meio da produção de ácido lático, peróxido de hidrogênio e bacteriocinas, criando um ambiente anti-inflamatório capaz de dificultar a infecção e favorecer o clearance viral. Em contraste, microbiotas caracterizadas por maior diversidade bacteriana, especialmente a Community State Types (CSTs) do tipo IV, associadas à vaginose bacteriana, apresentam redução de Lactobacillus spp. e, por vezes, aumento do pH, produção de aminas alifáticas e aumento da resposta inflamatória. Tais condições favorecem a infecção viral, prejudicam a resposta imune local e aumentam o risco de persistência e progressão das lesões cervicais. Em vista disso, estudos sugerem que determinados consórcios de microrganismos presentes no microambiente vaginal podem resultar na persistência do HPV e no desenvolvimento de lesões precursoras do CCU, da mesma maneira que a prevalência de espécies lactobacilares podem aumentar as taxas do clearance viral. Dessa forma, o estudo teve por objetivo avaliar a associação entre a composição taxonômica da microbiota vaginal e a persistência da infecção pelo HPV em mulheres submetidas à excisão de neoplasias intraepiteliais cervicais (NIC 2 e NIC 3), ao longo do período de seguimento de seis meses. Pacientes e Métodos: Trata-se de estudo satélite observacional e longitudinal, que incluiu 48 mulheres com NIC2 ou NIC 3 encaminhadas para conização de alta frequência no Departamento de Prevenção do Hospital do Câncer de Barretos (M0). Após seis meses de acompanhamento, as participantes foram estratificadas em dois grupos, de acordo com a evolução da infecção pelo HPV: HPV-clearance, mulheres com clareamento da infecção viral, e HPV-Persistence, mulheres com persistência da infecção por HPV de alto risco oncogênico. As participantes seguiram o protocolo padrão de acompanhamento do Hospital do Câncer de Barretos e, nos casos de corrimento vaginal, foi realizado o encaminhamento para as Unidades Básicas de Saúde (UBS), onde receberam tratamento conforme as diretrizes do município de Barretos. O estudo foi aprovado pelo sistema CEP/CONEP sob o número CAAE 71161023.5.0000.5437. Foram aplicados dois questionários nos dois momentos do estudo (M0 e M6), visando a coleta de informações referentes às características sociodemográficas, ao estilo de vida e ao comportamento sexual das participantes. Adicionalmente, incluíram variáveis relacionadas a fatores potenciais de interferência nos resultados da microbiota vaginal, como o uso de medicamentos intravaginais e antibioticoterapia recente. As amostras citológicas foram coletadas e preservadas em meio líquido (BD SurePath™). A genotipagem ampliada do HPV foi realizada utilizando a plataforma BD Onclarity HPV Assay, de acordo com as recomendações do fabricante. Para a análise molecular da microbiota vaginal, as amostras foram coletadas do terço médio da parede vaginal com swabs Copan e a extração total de DNA bacteriano foi realizada usando o kit ZymoBIOMICS™ DNA Miniprep. A biblioteca foi realizada seguindo o protocolo Illumina 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation. A região hipervariável V3–V4 do gene 16S rRNA foi amplificada por PCR usando primers específicos do locus com sequências de adaptadores Illumina overhang. Os amplicons foram purificados com esferas AMPure XP (Illumina) e submetidos a uma segunda PCR para indexação dupla com o Kit Nextera XT Index (Illumina). Os amplicons indexados foram purificados novamente com esferas AMPure XP, quantificados usando Qubit™ dsDNA HS Assay Kit, normalizados e agrupados em concentrações equimolares. A biblioteca final agrupada foi sequenciada em uma plataforma Illumina MiSeq (Illumina Inc.) usando o kit de sequenciamento paired-end 2 × 300 pb, de acordo com as recomendações do fabricante. Os arquivos fastq de leituras foward e reverse foram importados para o software R e as leituras foram processadas usando o pacote Dada2. As CSTs foram definidas usando o classificador VALENCIA, com base na composição das espécies bacterianas e abundâncias relativas. A análise dos dados foi realizada no software R utilizando pacotes do repositório Bioconductor e Tidyverse. A estrutura e organização dos dados da microbiota foram gerenciadas por meio do pacote Phyloseq, permitindo a integração das informações taxonômicas e clínicas. As análises estatísticas envolveram os pacotes Vegan e DESeq2, utilizados para avaliação da -diversidade e -diversidade, bem como para a análise de abundância diferencial entre grupos. A manipulação e transformação dos dados foram realizadas com os pacotes Dplyr, Tidyr e Reshape2, enquanto a visualização gráfica dos resultados foi efetuada com os pacotes Ggplot2 e GridExtra. As variáveis categóricas foram descritas por meio de frequências absolutas e relativas, e a associação entre elas foi avaliada utilizando-se o teste do quiquadrado de Pearson, adotando-se um nível de significância de 5%. Resultados: Das 48 mulheres incluídas no estudo, 37 (77,1%) delas tiveram clearance viral e em 11 (22,9%) a infecção persistente pelo HPV foi detectada. No M0, a maioria das pacientes foi caracterizada como pertencentes à CST III (46%), seguidas pelas CST IV (32,4%) e CST I (21,6%). Seis meses após a excisão (M6), 50,0% das pacientes seguiram apresentando o perfil da CST III. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre as comunidades bacterianas (M0 ou M6) e o desfecho de clearance viral (p = 0,644) ou persistência da infecção (p = 0,238). No grupo com clearance viral, 68,0% apresentavam L. iners dominante, enquanto 32,0% apresentavam L. crispatus. Entre as mulheres com infecção persistente, a distribuição foi análoga, com 85,7% apresentando predomínio de L. iners e 14,3% de L. crispatus, sem diferença estatística entre os grupos (p = 0,343). Após seis meses (M6), observou-se que todas as mulheres que apresentaram predominância de L. crispatus realizaram o clearance viral, em contraste com aquelas com predominância do L. iners (p= 0,065). Conclusão: Os dados desse estudo demonstram potencial correlação da microbiota vaginal associada à modulação do clearance viral do HPV, sugerindo não só um alvo terapêutico alternativo para os casos de câncer cervical, mas também aponta a importância da avaliação e manutenção da eubiose vaginal durante o curso da infecção pelo HPV.

Resumo (inglês)

Introduction: Cervical cancer (CC) remains one of the main public health problems among women, especially in developing countries that have limited access to screening and vaccination against Human Papillomavirus (HPV). Thus, persistent infection with high-risk oncogenic HPV is a necessary, but not sufficient, condition for the development of cervical intraepithelial lesions and invasive carcinoma. Although most HPV infections are transient, behavioral, environmental, immunological, and microbiological factors modulate the risk not only of viral acquisition but, above all, of its persistence. Recent evidence shows that vaginal microbiota has a decisive influence on the dynamics of HPV infection. Communities dominated by Lactobacillus spp., particularly L. crispatus, maintain an acidic pH through the production of lactic acid, hydrogen peroxide, and bacteriocins, creating an antiinflammatory environment that hinders infection and promotes viral clearance. In contrast, microbiota characterized by greater bacterial diversity, especially type IV Community State Types (CSTs) associated with bacterial vaginosis, show a reduction in Lactobacillus spp. and, sometimes, an increase in pH, production of aliphatic amines, and an increased inflammatory response. Such conditions favor viral infection, impair the local immune response, and increase the risk of persistence and progression of cervical lesions. In view of this, studies suggest that certain consortia of microorganisms present in the vaginal microenvironment may result in HPV persistence and the development of precancerous cervical lesions, just as the prevalence of lactobacillary species may increase viral clearance rates. Thus, the study aimed to evaluate the association between the taxonomic composition of the vaginal microbiota and the persistence of HPV infection in women undergoing excision of cervical intraepithelial neoplasia (CIN 2 and CIN 3) over a six-month follow-up period. Patients and Methods: This is an observational, longitudinal satellite study that included 48 women with CIN 2 or CIN 3 referred for high frequency conization at the Prevention Department of the Barretos Cancer Hospital (M0). After six months of follow-up, participants were stratified into two groups according to the evolution of HPV infection: HPV clearance, women with clearance of viral infection, and HPV persistence, women with persistent high-risk oncogenic HPV infection. The participants followed the standard follow-up protocol of the Barretos Cancer Hospital, and in cases of vaginal discharge, they were referred to Basic Health Units (UBS), where they received treatment according to the guidelines of the municipality of Barretos. The study was approved by the CEP/CONEP system under number CAAE 71161023.5.0000.5437. Two questionnaires were administered at two points in the study (M0 and M6) to collect information on the participants' sociodemographic characteristics, lifestyle, and sexual behavior. Additionally, variables related to potential factors that could interfere with the results of the vaginal microbiota, such as the use of intravaginal medications and recent antibiotic therapy, were included. Cytological samples were collected and preserved in liquid medium (BD SurePath™). Extended HPV genotyping was performed using the BD Onclarity HPV Assay platform, according to the manufacturer's recommendations. For molecular analysis of the vaginal microbiota, samples were collected from the middle third of the vaginal wall with Copan swabs, and total bacterial DNA extraction was performed using the ZymoBIOMICS™ DNA Miniprep kit. The library was prepared following the Illumina 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation protocol. The hypervariable V3–V4 region of the 16S rRNA gene was amplified by PCR using locus-specific primers with Illumina overhang adapter sequences. The amplicons were purified with AMPure XP beads (Illumina) and subjected to a second PCR for double indexing with the Nextera XT Index Kit (Illumina). The indexed amplicons were purified again with AMPure XP beads, quantified using the Qubit™ dsDNA HS Assay Kit, normalized, and pooled in equimolar concentrations. The final pooled library was sequenced on an Illumina MiSeq platform (Illumina Inc.) using the 2 × 300 bp paired-end sequencing kit, according to the manufacturer's recommendations. The fastq files of forward and reverse reads were imported into R software, and the reads were processed using the Dada2 package. CSTs were defined using the VALENCIA classifier, based on bacterial species composition and relative abundances. Data analysis was performed in R software using packages from the Bioconductor and Tidyverse repositories. The structure and organization of the microbiota data were managed using the Phyloseq package, allowing the integration of taxonomic and clinical information. Statistical analyses involved the Vegan and DESeq2 packages, used to evaluate α-diversity and β-diversity, as well as to analyze differential abundance between groups. Data manipulation and transformation were performed using the Dplyr, Tidyr, and Reshape2 packages, while graphical visualization of the results was performed using the Ggplot2 and GridExtra packages. Categorical variables were described using absolute and relative frequencies, and the association between them was evaluated using Pearson's chi-square test, adopting a significance level of 5%. Results: Of the 48 women included in the study, 37 (77.1%) had viral clearance, and persistent HPV infection was detected in 11 (22.9%). At TP1, most patients were characterized as belonging to CST III (46%), followed by CST IV (32.4%) and CST I (21.6%). Six months after excision (TP6), 50.0% of patients continued to present the CST III profile. No statistically significant differences were observed between bacterial communities (TP1 or TP6) and the outcome of viral clearance (p = 0.644) or persistence of infection (p = 0.238). In the group with viral clearance, 68.0% had dominant L. iners, while 32.0% had L. crispatus. Among women with persistent infection, the distribution was similar, with 85.7% having a predominance of L. iners and 14.3% of L. crispatus, with no statistical difference between the groups (p = 0.343). After six months (TP6), was observed that all women who had a predominance of L. crispatus achieved viral clearance, in contrast to those with a predominance of L. iners (p = 0.065). Conclusion: The data from this study demonstrate a potential correlation between vaginal microbiota and the modulation of HPV viral clearance, suggesting not only an alternative therapeutic target for cases of cervical cancer, but also pointing to the importance of assessing and maintaining vaginal eubiosis during HPV infection.

Palavras-chave

Infecção persistente, Microbiota vaginal, Papillomavírus humano, Metagenômica

Idioma

Português

Citação

SANTOS, Ana Carolina Sprocatti dos. Componentes da microbiota vaginal como correlatos da infecção cervical persistente pelo papilomavírus humano (HPV) em mulheres com excisão de lesões intraepiteliais cervicais de alto grau. Orientadora: Márcia Guimarães da Silva. 2026. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, 2026.