Adaptações na composição do sistema de transporte de elétrons mitocondrial em larvas de Drosophila melanogaster em resposta a restrição nutricional e a expressão da oxidase alternativa

Abstract

A oxidase alternativa mitocondrial (AOX) é naturalmente ausente em vertebrados e insetos, mas presente em tunicados como Ciona intestinalis. A expressão xenotópica de AOX de C. intestinalis em Drosophila melanogaster e camundongos tem mostrado resultados promissores no combate a disfunções mitocondriais, exibindo potencial para um futuro uso terapêutico. A AOX é uma enzima que pode contornar os complexos III e IV do sistema de transporte de elétrons mitocondrial (ETS), fornecendo um caminho adicional para a redução de oxigênio e a reoxidação da coenzima Q (CoQ), permitindo a continuação do fluxo metabólico em situações de disfunções da ETS. No entanto, em moscas que expressam AOX, há evidências sugerindo que essa enzima não consegue acessar à CoQ reduzida pelo complexo I, mas consegue acessar prontamente CoQ reduzidas pela glicerol-3-fosfato desidrogenase mitocondrial (mGPDH). A hipótese é que isso ocorra pelo fato do complexo I estar frequentemente formando supercomplexos (SCs) com os complexos III e IV, o que supostamente sequestra moléculas de CoQ, proporcionando condições que permitem que AOX se interaja funcionalmente e preferencialmente com enzimas fora de SCs, como mGPDH. No Capítulo 1 dessa dissertação, utilizamos linhagens transgênicas de D. melanogaster para modular os níveis de expressão de Gpo1, gene que codifica a isoforma ubíqua de mGPDH, e avaliamos um fenótipo característico de moscas AOX, que é a letalidade pupal induzida por limitação nutricional. Apesar de termos observado um resgate dessa letalidade quando Gpo1 foi superexpressa, notamos que várias das linhagens usadas não apresentaram as características genético-moleculares necessárias para termos confiança nos dados. No Capítulo 2, buscamos verificar como a ETS de Drosophila está organizado na presença e ausência de AOX e em condições nutricionais distintas, utilizando a etroforese em gel de poliacrilamida azul nativa (BN-PAGE). Observamos mudanças no padrão de distribuição e nos níveis dos complexos mitocondriais: 1) larvas apresentam maior abundância de complexos de maior peso molecular e SCs do que indivíduos adultos; 2) a presença de AOX aumenta uma das formas mais comuns de SC em larvas; e 3) a restrição nutricional promove aumento dos níveis dos complexos mitocondriais e SCs, independentemente da expressão de AOX em larvas. Nossos resultados indicam que o contexto molecular da membrana interna mitocondrial influencia a atividade de AOX.

Mitochondrial alternative oxidase (AOX) is naturally absent in vertebrates and insects, but present in tunicates such as Ciona intestinalis. The xenotopic expression of AOX from C. intestinalis in Drosophila melanogaster and mice has shown promising results in combating mitochondrial dysfunction, showing potential for future therapeutic use. AOX is an enzyme that can bypass complexes III and IV of the mitochondrial electron transport system (ETS), providing an additional pathway for oxygen reduction and coenzyme Q (CoQ) reoxidation, allowing continued metabolic flux in situations of ETS dysfunction. However, in flies expressing AOX, there is evidence suggesting that this enzyme cannot access CoQ reduced by complex I. but can readily access CoQ reduced by mitochondrial glycerol-3-phosphate dehydrogenase (mGPDH). The hypothesis is that this occurs because complex I is frequently forming supercomplexes (SCs) with complexes III and IV, which supposedly confine CoQ molecules, providing conditions that allow AOX to interact functionally and preferentially with enzymes outside of SCs, as mGPDH. In Chapter 1 of this dissertation, we used transgenic lines of D. melanogaster to modulate the expression levels of Gpo1, a gene that encodes the ubiquitous isoform of mGPDH, and we evaluated a characteristic phenotype of AOX flies, which is pupal lethality induced by nutritional limitation. Although we observed a rescue of this lethality when Gpo1 was overexpressed, we noticed that several of the strains used did not present the genetic-molecular characteristics necessary to be confident in the data. In Chapter 2, we sought to verify how the Drosophila ETS is organized in the presence and absence of AOX and in different nutritional conditions, using native blue polyacrylamide gel etrophoresis (BN-PAGE). We observed changes in the distribution pattern and levels of mitochondrial complexes: 1) larvae have a greater abundance of higher molecular weight complexes and SCs than adult individuals; 2) the presence of AOX increases one of the most common forms of SCs in larvae; and 3) nutritional restriction promotes an increase in the levels of mitochondrial complexes and SCs, independently of AOX expression in larvae. Our results indicate that the molecular context of the mitochondrial inner membrane influences AOX activity.