Estudo e aplicação da sonda fluorescente 4-dimetilamino-β-nitroestireno para caracterização de sítios de ligação em albumina

Abstract

As albuminas séricas são proteínas que possuem funções fisiológicas, entre elas, o transporte de fármacos na corrente sanguínea. Essa função é relevante, uma vez que a interação fármaco-BSA pode interferir na biodisponibilidade do fármaco no organismo, afetando a sua ação terapêutica. A albumina de soro bovino (BSA) possui dois principais locais de ligação para fármacos denominados sítio I e sítio II. A determinação do local de ligação de fármacos na albumina pode ser feita pelo uso de sondas fluorescentes. Neste trabalho, tivemos por objetivo estudar a interação do composto fluorescente 4dimetilamino- β -nitroestireno (DANS) com a BSA e avaliar se suas características solvatocrômicas poderiam ser úteis para caracterizar sítios de ligação e a polaridade no microambiente da proteína. Verificamos que ao se ligar a proteína, o DANS teve a sua fluorescência significativamente aumentada, revelando ser uma sonda fluorescente extrínseca para estudo de proteínas. Este fenômeno propiciou a obtenção da constante de associação do complexo (3,1 x 104 mol-1 L) e sua estequiometria BSA:DANS (1:1). A associação foi também estudada por quenching da fluorescência intrínseca da BSA pela complexação com DANS (3,9 x 104 mol-1 L). Através de estudos competitivos com fármacos que se ligam em sítios específicos da BSA, varfarina (sítio I), ibuprofeno (sítio II) e digitoxina (sítio III), verificamos que o DANS não apresenta uma preferência para qualquer um destes sítios. Estudos solvatocrômicos foram realizados e os modelos teóricos de Lippert-Mataga, Bilot-Kawski e McRae foram aplicados para o estabelecer a relação entre as propriedades espectroscópicas do DANS e a polaridade dos solventes. A melhor correlação foi obtida utilizando o modelo de Bilot-Kawski (r2 = 0,7565), no entanto, o modelo de McRae (r2 = 0,5740) foi o mais adequado para a simulação da constante dielétrica no interior da BSA (9,76). Utilizamos também o modelo de multiparamétrico de Kamlet-Taft. A partir deste modelo foi possível encontrar os máximos de absorbância e fluorescência do DANS para prever valores de parâmetros β (índice de basicidade) e π (fator de polarizabilidade) de misturas de solventes.

Serum albumins are proteins that have physiological functions, among them, the transport of drugs in the bloodstream. This function is relevant because the drug-BSA interaction can interfere in the bioavailability of the drug in the body, affecting its therapeutic action. Bovine serum albumin (BSA) has two main binding sites for drugs called site I and site II. Determination of the drug binding site in albumin can be done using fluorescent probes. In this work, the objective is to study the interaction of the fluorescent compound 4-dimethylamino-β-nitrostyrene (DANS) with BSA and to evaluate whether its solvatochromatic characteristics could be useful for the characterization of binding sites and polarity in the protein microenvironment. We found that by binding the protein, DANS had its fluorescence significantly increased, revealing it to be an extrinsic fluorescent probe for protein study. This phenomenon led to obtaining the association constant of the complex (3,1 x 104 mol-1 L) and its stoichiometry BSA:DANS (1:1). The association was also studied by BSA intrinsic fluorescence cooling by complexation with DANS (3,9 x 104 mol-1 L). Through competitive studies with drugs that link to specific BSA, warfarin (site I), ibuprofen (site II) and digitoxin (site III), we found that DANS does not have a preference for any of these sites. Solvatochromic studies were performed and the theoretical models of Lippert-Mataga, Bilot-Kawski and Mcrae were applied to establish the relationship between the spectroscopic properties of DANS and the polarity of solvents. The best correlation was obtained using the Bilot-Kawski model (r2 = 0,7565), however, the McRae model (r2 = 0,5740) was the most suitable for simulating the dielectric constant inside the BSA (9,76). We also used the Kamlet-Taft multiparametric model. From this model, it was possible to find the maximum absorbance and fluorescence of the DANS to predict values of parameters β (basicity index) and π (polarizability factor) of solvent mixtures.