Efeito do tempo de interação espermatozoide-oócito sobre a qualidade embrionária de bovinos

Abstract

A produção de embriões in vitro resulta em embriões com menor competência de desenvolvimento em comparação com a produção de embriões in vivo. Particularmente em bovinos, na fecundação in vitro (FIV), os espermatozoides são coincubados com oócitos maturados por período de 16 a 20 horas, para maximizar as taxas de produção. Por outro lado, in vivo, estima-se que a fecundação ocorra em 1 a 2 horas após a ovulação. Tendo em vista que na FIV os espermatozoides são coincubados com oócitos presumivelmente maduros, o período padrão de coincubação possivelmente expõe os gametas e zigotos recém-formados às espécies reativas ao oxigênio (EROs), o que pode comprometer a qualidade embrionária. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar o efeito do tempo de FIV sobre as taxas de desenvolvimento embrionário, incidência de polispermia, produção de EROs e qualidade embrionária em bovinos. No Experimento 1, os períodos de FIV de 2, 4, 6, 8, 10 e 16 horas foram avaliados para determinar o tempo mínimo necessário (Shrt/IVF; do inglês, Shrt=short) para atingir as taxas máximas de desenvolvimento, avaliando a primeira clivagem em 28 hpi (horas pós-inseminação), a clivagem em 96 hpi e a formação de blastocisto em 168 hpi. O estágio de formação de blastocisto (inicial, típico, expandido e eclodido) e o número de células também foram avaliados. Após a determinação do Shrt/IVF, no Experimento 2, os embriões produzidos com Shrt/IVF foram comparados aos produzidos com FIV de 16 horas (Controle; Ctrl/IVF) em relação à incidência de polispermia; níveis de EROs dos zigotos; expressão de genes relacionadas ao estresse oxidativo, proliferação celular e fatores de transcrição; número de células e taxa de proliferação dos embriões. Para a detecção dos níveis de EROs, os zigotos foram avaliados em três momentos: (1) após 8 horas de FIV (Shrt/IVF-8h); (2) após 16 horas, sendo 8 horas de FIV e 8 horas em desenvolvimento (Shrt/IVF-16h); e (3) após 16 horas de FIV (Ctrl/IVF-16h). As análises estatísticas foram realizadas no RStudio 4.4.2., aplicando o teste qui-quadrado para variáveis categóricas, ANOVA seguido pelo teste de Tukey para variáveis contínuas e o teste de Kruskal-Wallis para os níveis de EROs, com significância definida em P < 0,05. No Experimento 1, períodos de FIV inferiores a 6 h reduziram significativamente as taxas de primeira clivagem (P < 0,0001), e períodos inferiores a 8 h reduziram as taxas de clivagem (P < 0,0001); as taxas de blastocistos não foram alteradas por períodos de FIV superiores a 6 horas. Entretanto, em relação a classificação dos blastocistos, uma maior proporção (P = 0,008) de blastocisto expandido foi observada em 6, 8 e 10 horas. Assim, um período de FIV de 8 horas foi estabelecido como Shrt/IVF. No Experimento 2, embora o grupo Shrt/IVF (53,33 ± 4,54%) tivesse taxa de fecundação semelhante (P=0,15) aos embriões do grupo Ctrl/IVF (62,99 ± 4,28%), os embriões Shrt/IVF (9,16 ± 2,63%b) apresentaram menores (P=0,006) taxas de polispermia do que Ctrl/IVF (22,05 ± 3,68%a). O número de células dos blastocistos de Shrt/IVF (131,53 ± 5,17) foi maior (P=0,0003) em comparação aos blastocistos de Ctrl/IVF (104,14 ± 5,27), sem diferença na taxa de proliferação dos blastocistos (Shrt/IVF: 21,95 ± 4,25% vs. Ctrl/IVF: 24,85 ± 4,42%). Os níveis de EROs foram menores nos zigotos de Shrt/IVF-8h e Shrt/IVF-16h, em comparação com os zigotos de Ctrl/IVF-16h (P=0,0017). Além disso, observou-se uma tendência (P=0,07) para níveis mais elevados de SOD-2 em embriões de 2 células advindos de Shrt/IVF. Em conclusão, a redução do período de FIV para 8 horas diminui a taxa de polispermia e a presença de EROs no zigoto, preservando as taxas de fecundação e de formação de blastocisto. Este estudo fornece informações valiosas para o aprimoramento da biotecnologia de produção de embriões in vitro.

In vitro embryo production results in reduced developmental competence compared to in vivo conditions. Particularly in bovine, for in vitro fertilization (IVF), sperm and oocytes are usually co-incubated for a period of 16 to 20 hours to maximize fertilization rates. Whereas, in vivo, fertilization generally occurs within 1-2 hours after ovulation. Given that in IVF sperm are co-incubated with presumably mature oocytes, the standard 16–20-hours co-incubation period may represent a prolonged exposure time. This may lead to increased exposure of gametes and zygotes to reactive oxygen species (ROS), potentially compromising embryo quality. Herein, we investigated the effect of a shortened IVF period on embryo development rates, polyspermy incidence, ROS production, and embryo quality in cattle. In Experiment 1, IVF periods of 2, 4, 6, 8, 10, and 16 h were evaluated to determine the minimal exposure duration required to reach maximum developmental rates, evaluating first cleavage on 28 hpi (hours post-insemination), cleavage on 96 hpi, blastocyst on 168 hpi, and embryo quality (blastocyst stage, and cell number). Following determination of the shortened IVF period (Shrt/IVF) to reach proper developmental rates in Experiment 1, shrt/IVF was compared to standard 16-hour IVF (Control; ctrl/IVF) in Experiment 2, regarding polyspermy incidence, blastocyst cell number, proliferation, ROS levels, and expression of genes. For ROS levels detection, zygotes were evaluated at three moments: (1) after 8 hours of IVF (Shrt/IVF-8h); (2) after 18 hours with 8 hours of IVF and 8 hours of developmental culture (Shrt/IVF-16h); and (3) after 18 hours of IVF (Ctrl/IVF-16h). Statistical analyses were performed on RStudio 4.4.2, applying the chi-square test for categorical variables, ANOVA followed by Tukey’s test for continuous variables, and the Kruskal–Wallis test for ROS levels, with significance set at P < 0.05. In Experiment 1, IVF periods lower than 6 h significantly reduced first cleavage rates (P<0.0001), and periods lower than 8 h reduced cleavage rates (P<0.0001); blastocyst rates were not altered by IVF periods higher than 6 hours. However, regarding blastocysts, a higher (P = 0.008) rate of expanded blastocyst stage was observed at 6, 8, and 10 hours. Thus, an IVF period of 8 h was established as Shrt/IVF. In Experiment 2, while embryos of Shrt/IVF group displayed similar (P=0.15) fertilization rate compared to embryos of Ctrl/IVF (53.33±4.54% vs. 62.99±4.28%, respectively), the polyspermy rates were lower (P=0.006) for embryos of Shrt/IVF (9.16 ±2.63% b vs. 22.05 ±3.68%a). Blastocysts derived from Shrt/IVF displayed a higher number of cell (P=0.0003) compared to blastocysts from Ctrl/IVF (131.53±5.17a vs. 104.14± 5.27b), with no difference in blastocysts’ cell proliferation (Shrt/IVF: 21.95 ± 4.25% vs. Ctrl/IVF: 24.85 ± 4.42%). ROS levels were lower in zygotes from Shrt/IVF-8h and Shrt/IVF-16h, compared to zygotes from Ctrl/IVF-16h (P=0.0017). Furthermore, a tendency (P=0.07) toward higher SOD-2 gene expression in two-cell embryos from Shrt/IVF group was observed. In conclusion, reducing the IVF period to 8 hours decreases polyspermy rate and zygote ROS content, while preserving fertilization and blastocyst rates. This study provides valuable insights for improving in vitro embryo production biotechnology.