Publicação: Análise do impacto do nocaute do componente RNA da telomerase (LeishTER) nos telômeros, desenvolvimento e sobrevivência de Leishmania infantum
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Data
Autores
Orientador
Cano, Maria Isabel Nogueira 
Coorientador
Passos, Arthur de Oliveira
Pós-graduação
Curso de graduação
Botucatu - IBB - Ciências Biomédicas
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Trabalho de conclusão de curso
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (português)
A leishmaniose destaca-se como uma doença tropical negligenciada, transmitida por mosquitos flebotomíneos e amplamente distribuída em regiões de baixa renda, o que limita os incentivos para pesquisa e desenvolvimento de novos tratamentos. Leishmania infantum é o principal causador da leishmaniose visceral (LV) na América Latina, especialmente no Brasil, onde representa uma importante questão de saúde pública. A leishmaniose visceral (LV) é uma doença infecciosa sistêmica e a forma mais grave da doença, que afeta o fígado, o baço e a medula óssea, podendo ser fatal quando não tratada. Os medicamentos utilizados atualmente para tratar a LV não eliminam por completo o parasito do homem e nos cães domésticos, que são o principal reservatório do parasito. Por isso, encontrar alvos parasito-específico para o desenvolvimento de novas terapias contra a LV são de suma importância. Os telômeros, estruturas protetoras nas extremidades dos cromossomos, evitam degradações e fusões cromossômicas durante as divisões celulares, mantendo a estabilidade do genoma. A telomerase é uma enzima essencial para esse processo, pois adiciona sequências repetitivas aos telômeros, impedindo seu encurtamento progressivo, que está associado à senescência celular. O RNA da telomerase, em Leishmania conhecido como TER, é um componente fundamental do complexo ribonucleoproteico telomérico. Ele contém o molde para a síntese das repetições de DNA telomérico, que a subunidade catalítica TERT (Transcriptase Reversa da Telomerase) utiliza para estender o telômero. Assim, os telômeros e a telomerase influenciam a estabilidade genômica e a sobrevivência celular, especialmente em organismos com alta taxa de divisão, como L. infantum, tendo um papel crucial na sobrevivência e infectividade dos parasitos, tornando-a um alvo terapêutico promissor. Este trabalho objetiva criar linhagens de L. infantum com deleção dos dois alelos do gene que codifica o componente TER, para investigar como a ausência desse RNA afeta a estabilidade telomérica e a capacidade proliferativa do parasito. Para isso, utilizamos a técnica de edição gênica CRISPR-Cas9 para gerar mutantes nocaute de TER. A confirmação dos nocautes foi realizada por PCR e sequenciamento Sanger, que mostram a edição dos alelos que codificam o TER. Para avaliar o impacto da deleção de TER, realizamos análises de crescimento celular e de ciclo celular, além de análise de Southern blot para monitorar o encurtamento dos telômeros na linhagem nocaute. Essas investigações permitirão uma compreensão mais detalhada sobre a influência da telomerase na biologia de L. infantum, potencialmente revelando novos caminhos para terapias antiparasitárias.
Resumo (inglês)
Leishmaniasis stands out as a neglected tropical disease transmitted by phlebotomine sandflies, predominantly affecting low-income regions, which limits incentives for research and the development of new treatments. Leishmania infantum is the primary etiological agent of visceral leishmaniasis (VL) in Latin America, particularly in Brazil, where it represents a significant public health issue. VL is a systemic infectious disease and the most severe form of leishmaniasis, affecting the liver, spleen, and bone marrow, and can be fatal if untreated. The currently used drugs to treat VL do not completely eliminate the parasite from humans nor from domestic dogs, the main reservoir of the parasite. Therefore, identifying parasite-specific targets for developing new therapies against VL is of utmost importance. Telomeres, protective structures at the ends of chromosomes, prevent degradation and chromosomal fusion during cell division, ensuring genome stability. Telomerase is an essential enzyme in this process, adding repetitive sequences to telomeres and preventing their progressive shortening, which is associated with replicative senescence. The telomerase RNA, known as TER in Leishmania, is a fundamental component of the telomeric ribonucleoprotein complex. It contains the template for synthesizing telomeric DNA repeats, which the catalytic subunit TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) uses to extend telomeres. Thus, telomeres and telomerase influence genomic stability and cell survival, particularly in organisms with high division rates like L. infantum, playing a critical role in parasite survival and infectivity, and making telomerase a promising therapeutic target. This study aims to create L. infantum strains with both alleles of the TER-coding gene depleted to investigate how the absence of this RNA affects telomere stability and parasite proliferation capacity. In order to do so, we used the CRISPR-Cas9 gene-editing method to generate TER knockout mutants. The knockouts were confirmed through PCR and Sanger sequencing, which showed successful editing of the TER-coding alleles. To evaluate the impact of TER deletion, we conducted cell growth and cell cycle analyses, as well as Southern blot analysis to monitor telomere shortening in the knockout strains. These assessments will provide a more detailed understanding of telomerase's role in L. infantum biology, potentially revealing new avenues for antiparasitic therapies.
Descrição
Palavras-chave
Leishmania infantum, Leishmaniose, Sistema CRISPR-Cas9, Telomerase, RNA da Telomerase
Idioma
Português
