Arabinofuranosidases : caracterização de β-l-arabinofuranosidase de Chitinophaga sp. e α-l-arabinofuranosidase de Pycnoporus sanguineus

Abstract

O presente trabalho destaca a relevância das arabinofuranosidases, que são enzimas capazes de hidrolisar ligações glicosídicas de arabinofuranos, contribuindo para o aproveitamento eficiente da biomassa vegetal, sendo dividido em três partes: uma Introdução geral e dois capítulos. A introdução faz um levantamento bibliográfico sobre alfa e beta-L-arabinofuranosidases, as famílias GH às quais elas pertencem, aspectos estruturais e o mecanismo de ação, servindo como material inicial para a exploração da β-L-arabinofuranosidase da bactéria Chitinophaga sp. descrita no Capítulo 1, e da α-L-arabinofuranosidase do fungo Pycnoporus sanguineus abordada no Capítulo 2. No primeiro Capítulo, é apresentado um conjunto de dados sobre a estrutura e a função da β-L-arabinofuranosidase pertencente à família GH127, incluindo a descrição da sua mecânica de ação e a importância da atividade enzimática para processos industriais. São discutidos métodos de clonagem e expressão heteróloga de uma enzima de Chitinophaga sp. em Komagataella phaffii, e análises preliminares in silico que incluem a predição computacional da sua estrutura tridimensional por AlphaFold, em comparação com uma enzima da mesma família, porém descoberta em Bifidobacterium longum, e dinâmica molecular. No Capítulo 2, a investigação se refere a uma α-L-arabinofuranosidase fúngica, onde são relatados os métodos utilizados para o cultivo de diversas espécies de fungos (Myceliophthora heterothallica, Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Phebia sp, Pycnoporus sanguineus, Schizophyllum commune e Perenniporia medula-panis), o ensaio de atividade usando substrato sintético pNPAf, a purificação da enzima de Pycnoporus sanguineus por cromatografias de exclusão molecular e troca iônica. A produção da enzima mostrou estabilização após o quarto dia de cultivo, pH ótimo na faixa ácida, de 3,0 a 5,0. A temperatura ótima foi de 50 oC, mantendo a atividade até 60 minutos quando incubada a 60 oC, porém mostrando queda acima dessa temperatura. O efeito de cátions não mostrou nenhum capaz de aumentar a atividade, porém na presença de manganês houve uma diminuição significativa da atividade, superior a 50%. Diversas substâncias químicas foram testadas em 10 e 50 mmol L-1, mostrando efeitos inibitórios particularmente SDS nas duas concentrações, e DTT na maior concentração. Compostos fenólicos não induziram inibição significante, e chama a atenção o aumento da atividade na presença de ácido ferúlico. Foi também feita a análise cinética da enzima, mostrando que o comportamento não é compatível com o de uma enzima michaeliana, e sim alostérica, cooperativa. O melhor ajuste para os parâmetros de Vmax e Km mostrou 0,33 μmol min-1 e 1,32 mmol L-1 respectivamente, com uma cooperatividade de 1,65. Esse valor de cooperatividade é semelhante ao reportado para a glicocinase (1,7). Ambas as enzimas, β-L-arabinofuranosidase e α-L-arabinofuranosidase, apresentam potencial significativo para aplicações biotecnológicas, especialmente em processos de bioconversão de resíduos vegetais em produtos de valor agregado.

This work highlights the relevance of arabinofuranosidases, enzymes capable of hydrolyzing glycosidic bonds in arabinofuranose residues, thereby contributing to the efficient utilization of plant biomass. It is divided into three parts: a general introduction and two chapters. The introduction presents a literature review on α- and β-L-arabinofuranosidases, the glycoside hydrolase (GH) families to which they belong, their structural features, and mechanisms of action. This section serves as a foundation for the exploration of the β-L-arabinofuranosidase from the bacterium Chitinophaga sp., described in Chapter 1, and the α-L-arabinofuranosidase from the fungus Pycnoporus sanguineus, addressed in Chapter 2. Chapter 1 presents a set of data on the structure and function of the β-L-arabinofuranosidase belonging to GH family 127, including its mechanism of action and the industrial relevance of its enzymatic activity. It discusses cloning and heterologous expression methods of a Chitinophaga sp. enzyme in Komagataella phaffii, as well as preliminary in silico analyses. These include computational prediction of its three-dimensional structure using AlphaFold, in comparison to a homologous enzyme from Bifidobacterium longum, and molecular dynamics simulations. Chapter 2 investigates a fungal α-L-arabinofuranosidase, detailing the cultivation methods for several fungal species (Myceliophthora heterothallica, Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Phebia sp., Pycnoporus sanguineus, Schizophyllum commune, and Perenniporia medulla-panis), the enzymatic activity assay using the synthetic substrate pNPAf, and the purification of the enzyme from Pycnoporus sanguineus by size-exclusion and ion-exchange chromatography. The enzyme production stabilized after the fourth day of cultivation. The optimum pH was in the acidic range, between 3.0 and 5.0. The optimum temperature was 50 °C, with activity maintained for up to 60 minutes at 60 °C, but decreasing at higher temperatures. Cation analysis revealed no enhancement in activity by any tested ions; however, manganese caused a significant decrease, reducing activity by over 50%. Various chemical substances were tested at concentrations of 10 and 50 mmol L⁻¹, revealing inhibitory effects—particularly SDS at both concentrations, and DTT at the higher concentration. Phenolic compounds did not significantly inhibit the enzyme, and an increase in activity was observed in the presence of ferulic acid. Kinetic analysis indicated that the enzyme does not follow classic Michaelis-Menten behavior but rather exhibits allosteric cooperative kinetics. The best-fit parameters for Vmax and Km were 0.33 μmol min⁻¹ and 1.32 mmol L⁻¹, respectively, with a Hill coefficient of 1.65, comparable to that of glucokinase (1.7). Both enzymes, β-L-arabinofuranosidase and α-L-arabinofuranosidase, demonstrate significant potential for biotechnological applications, particularly in the bioconversion of plant residues into value-added products.