Impacto da edição de RUNX2A na regeneração de Zebrafish: análise funcional e de regulação por miRNAs

Abstract

A regeneração de estruturas perdidas é um fenômeno raro entre vertebrados, porém altamente eficiente em peixes teleósteos como o zebrafish (Danio rerio), que se destaca como modelo experimental devido à sua elevada capacidade regenerativa, genoma bem caracterizado e ampla disponibilidade de ferramentas moleculares. A regeneração da nadadeira caudal ocorre por mecanismo epimórfico, caracterizado pela formação do blastema, uma massa de células progenitoras responsável pela restauração tecidual. Neste trabalho, investigou-se o impacto da redução funcional do gene runx2a sobre a regeneração da nadadeira caudal, uma vez que esse gene codifica um fator de transcrição essencial para a diferenciação osteoblástica e formação óssea. Animais heterozigotos para runx2a obtidos por edição gênica via CRISPR/Cas9 foram utilizados, uma vez que mutantes homozigotos não sobreviveram ao desenvolvimento embrionário, reforçando a essencialidade do gene. Peixes selvagens (n = 5) e mutantes heterozigotos (n = 4) foram submetidos à amputação padronizada da nadadeira caudal e avaliados em 72 horas pós-amputação (72 hpa). A área regenerada foi mensurada morfometricamente em milímetros quadrados (mm²) e a expressão relativa dos microRNAs miR-203a-3p e miR-17-a1-3p foi avaliada por qPCR, empregando controle endógeno previamente validado. Devido à inviabilidade dos mutantes homozigotos e à baixa quantidade de tecido regenerado por indivíduo, foi realizado pooling de RNA por grupo, e os dados foram analisados de forma descritiva. A análise morfológica demonstrou áreas regeneradas semelhantes entre os grupos selvagem (6,1 mm²) e mutante (5,6 mm²), indicando manutenção da capacidade regenerativa inicial mesmo sob redução funcional de runx2a. Em contraste, ambos os microRNAs apresentaram superexpressão no grupo mutante, sugerindo envolvimento de mecanismos regulatórios compensatórios. A análise in silico por TargetScanFish (v6.2) identificou sítios de ligação para esses miRNAs na 3’UTR de runx2a e indicou possível participação do gene parálogo runx2b, frequentemente associado à redundância funcional em teleósteos, além de apontar associação com processos ontológicos de morfogênese de estrutura anatômica e diferenciação celular. Em conjunto, os resultados reforçam a essencialidade de runx2a para o desenvolvimento embrionário e indicam que a regeneração inicial da nadadeira pode ser mantida por mecanismos regulatórios mediados por microRNAs, evidenciando a elevada plasticidade molecular do sistema regenerativo do zebrafish diante de perturbações genéticas em genes centrais do desenvolvimento.

The regeneration of lost structures is a rare phenomenon among vertebrates, but highly efficient in teleost fish such as the zebrafish (Danio rerio), which stands out as an experimental model due to its high regenerative capacity, well-characterized genome, and wide availability of molecular tools. Caudal fin regeneration occurs through an epimorphic mechanism, characterized by the formation of the lastema, a mass of progenitor cells responsible for tissue restoration. In this study, we investigated the impact of the functional reduction of the runx2a gene on caudal fin regeneration, as this gene encodes a transcription factor essential for osteoblast differentiation and bone formation. Heterozygous runx2a animals obtained via CRISPR/Cas9 gene editing were used, since homozygous mutants did not survive embryonic development, reinforcing the gene's essentiality. Wild-type (n = 5) and heterozygous mutant (n = 4) fish underwent standardized caudal fin amputation and were evaluated at 72 hours post-amputation (72 hpa). The regenerated area was measured morphometrically in square millimeters (mm²), and the relative expression of microRNAs miR-203a-3p and miR-17-a1-3p was evaluated by qPCR, using a previously validated endogenous control. Due to the inviability of homozygous mutants and the low amount of regenerated tissue per individual, RNA pooling was performed per group, and data were analyzed descriptively. Morphological analysis demonstrated similar regenerated areas between the wild-type (6.1 mm²) and mutant (5.6 mm²) groups, indicating the maintenance of initial regenerative capacity even under functional reduction of runx2a. In contrast, both microRNAs showed overexpression in the mutant group, suggesting the involvement of compensatory regulatory mechanisms. In silico analysis using TargetScanFish (v6.2) identified binding sites for these miRNAs in the 3’UTR of runx2a and indicated possible participation of the paralogous gene runx2b, frequently associated with functional redundancy in teleosts, in addition to pointing to an association with ontological processes of anatomical structure morphogenesis and cellular differentiation. Together, the results reinforce the essentiality of runx2a for embryonic development and indicate that initial fin regeneration can be maintained by microRNAmediated regulatory mechanisms, highlighting the high molecular plasticity of the zebrafish regenerative system in the face of genetic perturbations in core developmental genes.