Mecanismos epigenéticos e a patogênese do pterígio: abordagem baseada na caracterização do perfil global de metilação do DNA

Abstract

O pterígio é uma condição oftalmológica comum e de alta recorrência, cuja etiologia permanece pouco compreendida, embora se reconheça sua origem multifatorial. Evidências recentes indicam que alterações na metilação do DNA, um dos principais mecanismos epigenéticos de regulação da expressão gênica, podem estar envolvidos na patogênese do pterígio. Considerando que a cabeça do pterígio é a região associada aos processos migratórios e proliferativos, investigá-la sob a perspectiva epigenética pode fornecer insights sobre os mecanismos que facilitam a invasão das células conjuntivais na córnea. Assim, este estudo visa caracterizar o perfil global de metilação do DNA na cabeça do pterígio, e comparar os genes diferencialmente expressos reportados na literatura. Ao todo, 12 amostras foram analisadas por sequenciamento RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing), incluindo seis amostras de pterígio primário, duas amostras pareadas de pterígio primário e recorrente, e dois pools de conjuntivas não expostas (NE-conjuntiva). A análise de metilação diferencial, para identificação de citosinas e regiões diferencialmente metiladas (DMCs e DMRs, respectivamente), foi realizada com o pacote methylKit, enquanto a anotação funcional, considerando o contexto CpG (ilhas, shores e shelves) e a localização genômica (promotor, corpo do gene ou região intergênica), foi conduzida com o pacote annotatr. Baseado nos genes relacionados às DMRs, foi realizada a análise de enriquecimento de vias para investigar os mecanismos moleculares subjacentes, com o pacote gProfiler. Deste modo, foram identificadas 1759 DMCs entre as amostras de pterígio e NE-conjuntiva. As amostras primárias agruparam-se em um cluster distinto, enquanto as amostras recorrentes exibiram um perfil molecular divergente, sem formar um agrupamento coeso com as demais. Com base nessa distinção, realizamos uma análise comparativa entre a NE-conjuntiva e os dois subgrupos do pterígio separadamente. Assim, foram identificadas 704 DMRs no pterígio primário e 1641 DMRs no pterígio recorrente. Em ambas as comparações, genes importantes da via de sinalização Wnt (WNT7B e WNT9A) foram detectados hipermetilados no corpo do gene, sugerindo um mecanismo regulatório que leva ao aumento da expressão desses genes, complementando dados transcriptômicos da literatura. Múltiplos genes da superfamília das caderinas, em especial as caderinas clássicas e protocaderinas, foram identificados diferencialmente metilados, sugerindo alterações em vias de adesão celular. De modo geral, nossos dados indicam que a metilação do DNA pode desempenhar um papel relevante na origem e progressão do pterígio, impactando funcionalmente genes envolvidos em vias e processos anteriormente identificados como diferencialmente expressos em estudos transcriptômicos. Esses achados são valiosos para direcionar estudos subsequentes, e sugerem que a modulação epigenética pode desempenhar papel importante na patogênese do pterígio.

Pterygium is a common ocular condition with a high recurrence rate. Its etiology remains poorly understood, although it is recognized as a multifactorial lesion. Recent evidences suggest that alterations in DNA methylation, an epigenetic mechanism that regulates gene expression, may be involved in pterygium pathogenesis. Considering that the head of the pterygium is the region associated with migratory and proliferative processes, investigating it from an epigenetic perspective may provide insights into the mechanisms that facilitate conjunctival cell invasion into the cornea. In this sense, this study aimed to characterize the global DNA methylation profile in the pterygium head and compare the findings with differentially expressed genes previously reported in the literature. In total, 12 samples were analyzed by Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS), including six primary pterygium tissues, two paired primary and recurrent samples, and two pools of non-exposed conjunctival tissues (NE-conjunctiva). Differential methylation analysis was performed to identify differentially methylated cytosines (DMCs) and regions (DMRs), using the methylKit package, while functional annotation, considering the CpG context (islands, shores, and shelves) and the genomic location (promoter, gene body, or intergenic region), was conducted with the annotatr package. Based on the genes associated with DMRs, pathway enrichment analysis was performed using the gProfiler package to explore underlying molecular mechanisms. A total of 1759 DMCs were identified between pterygium and NE-conjunctiva. Primary samples clustered into a distinct group, whereas recurrent samples displayed a divergent molecular profile, not forming a cohesive cluster with the others. Based in this analysis, we performed a comparative analysis between NE-conjunctiva and the two pterygium subgroups separately. In this manner, 704 DMRs were identified in primary pterygium and 1641 DMRs in recurrent pterygium. In both comparisons, key Wnt signaling pathway genes (e.g., WNT7B and WNT9A) were found hypermethylated within the gene body, suggesting a regulatory mechanism that leads to increased gene expression, consistent with transcriptomic data reported in the literature. Additionally, multiple genes from the cadherin superfamily, particularly classical cadherins and protocadherins, were differentially methylated, indicating alterations in cell adhesion pathways. Overall, our data suggest that DNA methylation may play a relevant role in the onset and progression of pterygium by functionally impacting genes involved in pathways previously identified as differentially expressed by transcriptomic studies. These findings are valuable to guide future research and suggest that epigenetic modulation may play an important role in the pathogenesis of pterygium.