Publicação: Elucidação do mecanismo de reação da sonda luminescente AMPPD com a proteína albumina sérica humana
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Data
Autores
Orientador
Ximenes, Valdecir Farias 
Coorientador
Pós-graduação
Ciência e Tecnologia de Materiais - FC/FCAT/FCLAS/FCT/FEB/FEC/FEG/FEIS/IBB/ICE/ICTS/IQAR
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Tese de doutorado
Direito de acesso
Acesso aberto
Resumo
Resumo (português)
Compostos quimioluminescentes pertencem a um grupo restrito de moléculas que possuem a capacidade de emitir luz após uma reação química. Neste campo, destacam-se aquelas cujo mecanismo para geração de estados excitados envolvem a clivagem de peróxidos cíclicos conhecidos como dioxetanos. Uma destas moléculas é o 3-(2'espiroadamantil)-4-metoxi-4-(3″-fosforiloxi)-fenil-1,2-dioxetano (AMPPD), que devido a sua estabilidade e disparo controlado de emissão pela enzima fosfatase alcalina (ALP), é utilizado em larga escala em sistemas automatizados em laboratórios clínicos para detecção de hormônio, análise imunológicas entre outras. Em análises deste tipo, o AMPPD poderia entrar em contato com a albumina de soro humano (HSA), que é proteína mais abundante do plasma sanguíneo. Considerando a alta capacidade de ligação da HSA, pode-se esperar sua interação com o AMPPD, o que poderia interferir nas determinações quimioluminescentes que utilizam o AMPPD. Portanto, este trabalho teve por objetivo avaliar e elucidar a interação entre o AMPPD e a proteína HSA e determinar possíveis efeitos na performance de emissão de luz na presença da enzima ALP. Descobriu-se que a emissão de luz do sistema AMPPD/ALP é significativamente afetado pela presença de HSA, tendo sua emissão de luz aumentada em cerca de 100 vezes. Este efeito foi elucidado estudando a eficiência de ligação entre o AMPPD e a HSA que resultou em uma constante de ligação de 1.9x105 M-1. Por meio de marcadores de sítio de ligação, verificou-se que a interação se dá preferencialmente no sítio I da HSA. Estudos de docagem molecular corroboraram este achado. Os estudos indicaram ainda que após hidrólise pela ALP, o AMPPD desfosforilado se difunde para a HSA, onde encontra um microambiente que favorece o aumento do rendimento quântico de emissão de fluorescência da espécie gerada pela clivagem do AMPPD (metil-meta-oxibenzoato), o que explica o efeito da HSA na emissão de luz. Verificou-se também que a albumina de soro bovino (BSA) não tem a mesma eficiência na amplificação da emissão de luz, o que reforça uma interação específica com a HSA. Estudos realizados na presença da sonda fluorescente coumarina-153 evidenciou a transferência de energia de ressonância (RET) do éster excitado metil-meta-oxibenzoato para a coumarina-153. Este achado reforçou as evidências de que ambos estavam complexados a HSA. Em conclusão, estes resultados inéditos sobre o efeito de albumina no sistema AMPPD/ALP poderão ser úteis para a aplicação desse sistema quimioluminescente em análises clínicas e para pesquisadores que trabalham no desenvolvimento de novos sistemas quimioluminescentes.
Resumo (inglês)
Chemiluminescent compounds belong to a restricted group of molecules that can emit light after a chemical reaction. In this field, those whose mechanism for generating excited states involves the cleavage of cyclic peroxides known as dioxetanes stand out. One of these molecules is 3-(2'-spiroadamantyl)-4-methoxy-4-(3″-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetane (AMPPD), which, due to its stability and controlled emission triggering by the enzyme alkaline phosphatase (ALP), is widely used in automated systems in clinical laboratories for hormone detection, immunological analysis, among others. In analyses of this type, AMPPD could come into contact with human serum albumin (HSA), which is the most abundant protein in blood plasma. Considering the high binding capacity of HSA, its interaction with AMPPD can be expected, which could interfere in chemiluminescent determinations that use AMPPD. Therefore, this work aimed to evaluate and elucidate the interaction between AMPPD and the HSA protein and to determine possible effects on the light emission performance in the presence of the ALP enzyme. It was found that the light emission of the AMPPD/ALP system is significantly affected by the presence of HSA, with its light emission being increased by approximately 100 times. This effect was elucidated by studying the binding efficiency between AMPPD and HSA, which resulted in a binding constant of 1.9x105 M-1. Through binding site markers, it was verified that the interaction occurs preferentially at site I of HSA. Molecular docking studies corroborated this finding. The studies also indicated that after hydrolysis by ALP, dephosphorylated AMPPD diffuses to HSA, where it encounters a microenvironment that favors an increase in the quantum yield of fluorescence emission of the species generated by AMPPD cleavage (methyl-meta-oxybenzoate), which explains the effect of HSA on light emission. It was also found that bovine serum albumin (BSA) does not have the same efficiency in amplifying light emission, reinforcing a specific interaction with HSA. Studies performed in the presence of the fluorescent probe coumarin-153 demonstrated resonance energy transfer (RET) from the excited ester methyl-meta-oxybenzoate to coumarin-153. This finding reinforced the evidence that both were complexed to HSA. In conclusion, these unprecedented results on the effect of albumin on the AMPPD/ALP system may be useful for the application of this chemiluminescent system in clinical analyses and for researchers working on the development of new chemiluminescent systems. Keywords: AMPPD, Albumin, Alkaline Phosphatase, Chemiluminescence, Molecular Docking, Fluorescence, RET.
Descrição
Palavras-chave
AMPPD, Albumina, Fosfatase alcalina, Quimioluminescência, Docking Molecular, Fluorescência, RET, Albumin, Alkaline phosphatase, Chemiluminescence, Molecular docking, Fluorescence
Idioma
Português
Como citar
BARISON, Leonardo Almeida. Elucidação do mecanismo de reação da sonda luminescente AMPPD com a proteína albumina sérica humana. Orientador: Valdecir Farias Ximenes. 2025. 99 f. Tese (Doutorado em Ciência e Tecnologia de Materiais) - Faculdade de Ciências, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Bauru, 2025.
