Investigação do envolvimento de CENP-A na facilitação do reparo de DNA promovida pela HJURP

Abstract

Os gliomas representam os tumores cerebrais primários mais comuns, sendo que o glioblastoma (GB) é considerado o mais agressivo e letal, caracterizado pela alta resistência das células tumorais aos tratamentos e pela capacidade de recidiva, resultando em uma expectativa de vida média de apenas 14 meses após o diagnóstico. Um fator importante para a gravidade do GB é a expressão elevada da proteína HJURP, anteriormente associada ao pior prognóstico e à resistência à radiação ionizante. HJURP é amplamente reconhecida por sua função como chaperona da variante centromérica da histona H3, CENP-A. HJURP é fundamental para a incorporação de CENP-A nos centrômeros, o que favorece a descompactação da cromatina e contribui para a formação de cinetócoros funcionais. Além disso, estudos recentes indicam que HJURP atua no reparo de quebras de dupla-fita do DNA, facilitando o processo de descompactação da cromatina nas regiões lesionadas. No entanto, o papel da CENP-A nessa resposta permanece incerto. O objetivo deste trabalho foi investigar se a CENP-A é necessária para a função de reparo mediada pela HJURP. Inicialmente, avançamos em várias etapas experimentais essenciais para a investigação dessa questão. Foram definidas e padronizadas as sequências mais adequadas de siRNA para o silenciamento do CENP-A. A eficiência do silenciamento foi verificada por qRT-PCR e western blot, confirmando a supressão da proteína CENP-A com a manutenção de altos níveis de HJURP. Em seguida, foi padronizado o uso de bleomicina para induzir quebras de dupla-fita de DNA (DSBs) em níveis adequados e sem causar morte excessiva das células. A padronização bem-sucedida deste sistema experimental viabilizou explorar a participação da CENP-A no reparo de DNA promovido por HJURP. Para isso, foi realizada a cinética de restauração de DSBs induzidas por bleomicina, utilizando o ensaio do cometa. Os resultados indicaram que a superexpressão da HJURP contribui para uma redução significativa nos DSBs, especialmente após 6 horas, demonstrando que a HJURP favorece um reparo mais eficiente do DNA. Curiosamente, o silenciamento de CENP-A não impactou significativamente na porcentagem de DSBs reparados, indicando que CENP-A não é essencial para o processo de reparo facilitado pela HJURP. Essas descobertas foram corroboradas por experimentos de western blot que analisaram a fosforilação de H2AX (γH2AX), um marcador de sinalização de dano ao DNA. Os níveis de γH2AX foram reduzidos em células superexpressoras de HJURP, confirmando seu papel no processamento das lesões. Importantemente, os resultados também sugeriram que a presença CENP-A não interfere na capacidade de processamento e reparo de lesões executada pela HJURP, pois células silenciadas ou não para CENP-A não mostraram diferenças na quantidade de γH2AX. Além disso, foi observada uma indução inesperada na expressão de HJURP em algumas condições experimentais, o que pode estar relacionado ao silenciamento de CENP-A e ao insulto com bleomicina, um achado que merece investigação adicional. Concluindo, os resultados sugerem que a HJURP desempenha um papel central no reparo de DSBs em GB, enquanto a CENP-A parece não ser necessária para essa função. Esses dados avançam no entendimento da dinâmica entre HJURP e CENP-A, com implicações potenciais para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas voltadas para a sensibilidade das células de GB à radioterapia.

Gliomas represent the most common primary brain tumors, with glioblastoma (GB) considered the most aggressive and lethal, characterized by high resistance of tumor cells to treatments and a tendency to recur, resulting in an average life expectancy of only 14 months after diagnosis. An important factor contributing to the severity of GB is the elevated expression of the HJURP protein, previously associated with a poorer prognosis and resistance to ionizing radiation. HJURP is widely recognized for its role as a chaperone of the centromeric histone H3 variant, CENP-A. HJURP is crucial for the incorporation of CENP-A into centromeres, promoting chromatin decompaction and contributing to the formation of functional kinetochores. Additionally, recent studies indicate that HJURP plays a role in repairing DNA double-strand breaks (DSBs), facilitating chromatin decompaction in damaged regions. However, the role of CENP-A in this response remains unclear. This study aimed to investigate whether CENP-A is required for HJURP-mediated repair function. Initially, we advanced through several experimental steps essential to investigate this question. The most suitable siRNA sequences for CENP-A silencing were identified and standardized. Silencing efficiency was verified by qRT-PCR and western blot, confirming CENP-A protein suppression while maintaining high HJURP levels. Next, the use of bleomycin was standardized to induce DNA double-strand breaks at appropriate levels without causing excessive cell death. The successful standardization of this experimental system enabled exploration of CENP-A’s involvement in HJURP-promoted DNA repair. To this end, we performed a kinetic analysis of bleomycin-induced DSB restoration using the comet assay. Results indicated that HJURP overexpression contributes to a significant reduction in DSBs, particularly after 6 hours, demonstrating that HJURP facilitates more efficient DNA repair. Interestingly, CENP-A silencing did not significantly impact the percentage of repaired DSBs, suggesting that CENP-A is not essential for HJURP-facilitated repair. These findings were corroborated by western blot experiments analyzing H2AX phosphorylation (γH2AX), a marker of DNA damage signaling. γH2AX levels were reduced in HJURP-overexpressing cells, confirming its role in processing lesions. Importantly, the results also suggested that the presence of CENP-A does not interfere with HJURP’s processing and repair capabilities, as cells with or without CENP-A silencing showed no differences in γH2AX levels. Furthermore, an unexpected increase in HJURP expression was observed under certain experimental conditions, potentially related to CENP-A silencing and bleomycin insult, a finding that warrants further investigation. In conclusion, the results suggest that HJURP plays a central role in DSB repair in GB, while CENP-A appears to be unnecessary for this function. These data advance our understanding of the dynamics between HJURP and CENP-A, with potential implications for the development of new therapeutic strategies aimed at increasing GB cell sensitivity to radiotherapy.