Publicação: Investigação de ligantes para o domínio globular da proteína M2-1 como potenciais antivirais contra o Vírus Sincicial Respiratório humano
Carregando...
Data
2025-02-13
Autores
Orientador
Putinhon, Ícaro Caruso 
Coorientador
Pós-graduação
Ciências Biomoleculares e Farmacológicas - IBILCE
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Dissertação de mestrado
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (português)
Os vírus respiratórios são responsáveis por significativa morbidade, mortalidade e perdas econômicas globais. O Vírus Sincicial Respiratório humano (hRSV) é um dos principais agentes de infecções respiratórias agudas graves em prematuros, idosos e imunocomprometidos. Atualmente, as formas de tratamento profilático incluem vacinas aprovadas pela FDA para idosos e gestantes, além do medicamento Palivizumab, um anticorpo monoclonal que visa a proteína de fusão. Para ambos os tratamentos, destaca-se que são métodos para prevenir ou amenizar um possível quadro da doença, o que evidencia a necessidade de um tratamento terapêutico para pacientes com quadros mais graves. Neste sentido, a proteína M2-1 do hRSV é um fator de antiterminação transcricional fundamental para o ciclo de replicação do vírus, com suas funções mediadas pela interação de seu domínio globular (dgM2-1) com parceiros biológicos como o RNA e a fosfoproteína viral, caracterizando-se como um potencial alvo para o desenvolvimento de antivirais. Assim, o presente trabalho teve como objetivo investigar possíveis ligantes para o dgM2-1 como potenciais antivirais com base em duas vertentes: i) a aplicação de um método sistematizado para identificar novas pequenas moléculas ligantes, como a abordagem da triagem de fragmentos por RMN, e ii) o uso de uma característica físico-química presente no dgM2-1, sua extensa superfície carregada positivamente, favorável para interação com moléculas de carga líquida negativa como a suramina. Para a triagem, foram selecionados sete fragmentos mais promissores de uma biblioteca com ~700, baseado nas medidas de perturbação de deslocamento químico, tempo de relaxação transversal e WaterLOGSY. Esses fragmentos identificados apresentaram resultados positivos para ao menos dois parâmetros utilizados na triagem, e foram selecionados para análise de diferença de transferência de saturação, entretanto, um foi excluído da análise de 15N HSQC devido a questões de solubilidade. A partir dos experimentos de STD e HSQC, observou-se que quatro dos fragmentos selecionados apresentaram interação satisfatória, sendo essa próximo aos resíduos das hélices α2, α4, α5 e α6 do dgM2-1, regiões importantes para a interação do domínio com RNA e a fosfoproteína viral. Os fragmentos selecionados tiveram sua capacidade de competição com o peptídeo P90-110, fragmento da fosfoproteína, testada através de experimentos de anisotropia de fluorescência, para os quais três dos quatro fragmentos apresentaram competição com o P90-110, com destaque para o fragmento P2_C07, que proporcionou maior aumento da Kd do complexo dgM2-1/P90-110. Para a análise de interação dgM2-1/suramina, experimentos de fluorescência mostram um melhoramento do sinal de emissão da suramina na presença de concentrações crescentes de dgM2-1. A partir deste experimento, a construção de uma isoterma de ligação possibilitou a determinação da constante de dissociação (K_d) de ~13 nM para o complexo dgM2-1/suramina. A análise termodinâmica para os valores de K_d nas temperaturas de 15, 25 e 35 °C revelou uma variação de entalpia de ligação significativamente reduzida frente a principal contribuição entrópica para a energia livre de Gibbs, sugerindo uma contribuição eletrostática importante para a formação do complexo dgM2-1/suramina, o que corroborou com o experimento de competição com NaCl. Outros experimentos de competição de suramina com RNA e um fragmento da fosfoproteína viral (P96-110) para o sítio de ligação no dgM2-1 revelaram que a molécula polissulfatada é deslocada por ambos os parceiros biológicos naturais, indicando que a suramina interage tanto nos sítios de ligação do RNA quanto do P96-110. Portanto, o presente estudo apresenta dados moleculares relevantes para o desenho de novas estratégias de combate a infecções causadas pelo hRSV.
Resumo (inglês)
Respiratory viruses are responsible for significant morbidity, mortality, and global economic losses, with Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) being one of the main agents of severe acute respiratory infections in premature infants, elderly, and immunocompromised individuals. Currently, prophylactic treatments include FDA-approved vaccines for the elderly and pregnant women, as well as the drug Palivizumab, a monoclonal antibody targeting the fusion protein. Both treatments are methods to prevent or mitigate a possible disease condition, highlighting the need of a therapeutic treatment for patients with more severe conditions. In this sense, the M2-1 protein of hRSV is a crucial transcriptional antitermination factor for the virus replication cycle, with its functions mediated by the interaction of its core domain (cdM2-1) with biological partners, RNA, and viral phosphoprotein, making it a potential target for the development of antivirals. Thus, the present work aimed to investigate potential ligands for cdM2-1 as potential antivirals based on two approaches: i) the application of a systematic method to identify new small molecule ligands, such as the fragment screening approach by NMR, and ii) the use of a physicochemical characteristic present in M2-1/cdM2-1, its extensive positively charged surface, favorable for interaction with negatively charged molecules like suramin. For the screening, seven of the most promising fragments from a library of ~700 were selected, based on chemical shift perturbation measurements, transverse relaxation time, and WaterLOGSY. These identified fragments showed positive results for at least two parameters used in the screening and were selected for saturation transfer difference analysis, for which two did not show satisfactory results and were excluded from the 15N HSQC stage. From the HSQC experiments, it was observed that the selected fragments interacted in the α2, α4, α5, and α6 helices of dgM2-1, important regions for the domain's interaction with RNA and the viral phosphoprotein. The selected fragments had their ability to compete with the P90-110 peptide, a fragment of the phosphoprotein, tested through fluorescence anisotropy experiments. Three out of the four fragments showed competition with P90-110, with particular emphasis on the P2_C07 fragment, which resulted in the greatest increase in the Kd of the cdM2-1/P90-110 complex. For the cdM2-1/suramin interaction analysis, fluorescence experiments showed an improvement in suramin emission signal in the presence of increasing concentrations of cdM2-1. From this experiment, constructing a binding isotherm enabled the determination of the dissociation constant (Kd) of ~13 nM for the cdM2-1/suramin complex. Thermodynamic analysis for Kd values at 15, 25, and 35 °C revealed a significantly reduced binding enthalpy variation against the main entropic contribution to Gibbs free energy, suggesting an important electrostatic contribution to the cdM2-1/suramin complex formation, corroborated by the competition experiment with NaCl. Other competition experiments of suramin with RNA and a fragment of the viral phosphoprotein (P96-110) for the binding site on dgM2-1 revealed that the polysulfated molecule is displaced by both natural biological partners, indicating that suramin interacts with both RNA and P96-110 binding sites. Therefore, this study presents relevant molecular data for designing new proposals for strategies to combat infections caused by hRSV.
Descrição
Palavras-chave
Idioma
Português
Como citar
FERREIRA JÚNIOR, Sérgio Luís. Investigação de ligantes para o domínio globular da proteína M2-1 como potenciais antivirais contra o Vírus Sincicial Respiratório humano. Dissertação (Mestrado em Ciências Biomoleculares e Farmacológicas). 2025 – Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas (Ibilce), São José do Rio Preto, 2025.
