Modulação da produção metabólica de Botryosphaeria parva utilizando a abordagem OSMAC, e sua co-cultura com o endófito Pseudofusicoccum stromaticum

Abstract

Os micro-organismos constituem uma das mais importantes formas de vida que fornecem substâncias que podem ser utilizadas em diversas áreas, como: farmacêutica, bioquímica, alimentícia e agropecuária. A abordagem OSMAC (One Strain Many Compounds), visa, na mudança nos parâmetros de cultivos de micro-organismos, diversificar e aumentar a produção de metabólitos secundários de uma única cepa. O fungo endofítico Botryosphaeria parva, oriundo das folhas de Syzygium cumini (L.) Skeels, foi submetido à abordagem OSMAC variando-se os meios de cultivo: Arroz parboilizado (meio sólido), Extr. de Malte, Nutrient, PDB e YM (meios líquidos), e o fungo endofítico Pseudofusicoccum stromaticum, oriundo dos frutos maduros de S. cumini (L.) Skeels, foi cultivado em meio de Extr. de Malte. Após o período de fermentação de B. parva em meio sólido, iniciou-se uma extração direta com CH3OH, seguida de filtração e evaporação do solvente. O extrato obtido foi solubilizado em AcOEt e realizou-se três partições líq.-líq. com H2O, em que após a evaporação do solvente orgânico, o extrato obtido foi dissolvido em CH3CN e foi realizada uma nova partição líq.-líq. com Hexano, e após evaporação da CH3CN, foi obtido o extrato de interesse. Após o período de fermentação dos endófitos nos meios líquidos, as suspensões micelares foram filtradas a pressão reduzida, separando os micélios dos meios fermentados. Em seguida, os filtrados aquosos foram submetidos a três partições líq.-líq. com AcOEt, e após a evaporação do solvente orgânico, foram obtidos os extratos de B. parva e P. stromaticum, nos meios líquidos. Os extratos de B. parva, em meio de arroz parboilizado e extr. de malte, e o extrato de P. stromaticum foram fracionados utilizando técnicas cromatográficas, como Cromatografia em Coluna e/ou Cromatografia Líquida de Alta Eficiência preparativa, em que após os fracionamentos, foram obtidas 33 substâncias oriundas de B. parva e 11 substâncias de P. stromaticum, caracterizadas por meio de análises espectrométricas (EM, RMN 1D e 2D) e pertencentes à diversas classes químicas, como: terpenos, isocumarinas, dicetopiperazinas, compostos fenólicos, ftaletos, pirazinas, pirrololactonas e pentapeptídeos cíclicos. Dentre as 40 substâncias identificadas, 11 são inéditas: botryosftaleto A (04), botryospirazina A (05), botryosarina A (06), botryosphaerina J (07), botryosarina B (08), botryosphaerina K (09), botryosphaerina L (20), 4-hidroxiterpestacina (21), botryosbenzofuranona A (26), botryosbenzenodiol A (28), botryosbenzenodiol B (32). O estudo da co-cultura dos endófitos foi realizado em meio de ext. de malte e ao final do período de fermentação o caldo fermentado foi submetido a três partições líq.-líq. com AcOEt, e o extrato foi gerado após a evaporação do solvente orgânico. A análise do extrato via CLAE-EM indicou a produção de 13 substâncias que não foram detectadas nas monoculturas, e destas, oito não apresentaram registros em quatro bases de dados (massBank, Metlin, GNPS e Dicionário de Produtos Naturais), sendo consideradas inéditas, mas ainda a serem identificadas. Os estudos relacionados ao B. parva e P. stromaticum têm como finalidade verificar suas produções metabólicas frente a diferentes estímulos, bem como avaliar o potencial biológico dos extratos, nos ensaios antibacteriano, antiglicante, antioxidante, antifúngico, anticolinesterásico e citotóxico, em que os extratos de B. parva apresentaram atividades anticolinesterásica, antifúngica e citotóxica, e o extrato de P. stromaticum apresentou atividades antiglicante antioxidante e citotóxica.

Microorganisms are one of the most important forms of life that provide substances that can be used in several areas, such as: pharmaceutical, biochemistry, food and agriculture. The OSMAC approach (One Strain Many Compounds) aims, in changing the parameters of microorganism cultures, to diversify and increase the production of secondary metabolites from a single strain. The endophytic fungus Botryosphaeria parva, from the leaves of Syzygium cumini (L.) Skeels, was subjected to the OSMAC approach by varying the culture media: Parboiled rice (solid medium), Malt Ext., Nutrient, PDB and YM (liquid media); and the endophytic fungus Pseudofusicoccum stromaticum, from the ripe fruits of S. cumini (L.) Skeels, was grown in Malt Ext. After the fermentation period of B. parva in solid medium, a direct extraction with MeOH was started, followed by filtration and evaporation of the solvent. The obtained extract was solubilized in AcOEt and three liq.-liq. partitions were performed with H2O, where after evaporation of the organic solvent, the extract obtained was solubilized in CH3CN and a new liq.-liq. partition was performed with Hexane, and after evaporation of CH3CN, the extract of interest was obtained. After the endophytes fermentation period in liquid media, the micellar suspensions were filtered under reduced pressure, separating the mycelia from the fermented media. Then, the aqueous filtrates were subjected to three liq.-liq. partitions with AcOEt, and after evaporation of the organic solvent, extracts of B. parva and P. stromaticum were obtained in liquid media. B. parva extracts in parboiled rice and malt ext., and P. stromaticum extract were fractionated using chromatographic techniques, such as Column Chromatography and/or Preparative High Performance Liquid Chromatography, in which after fractionation, 33 substances of B. parva and 11 substances of P. stromaticum were obtained and characterized by spectrometric analysis (MS, 1D an 2D NMR), belonging to several chemical classes, such as: terpenes, isocoumarins, diketopiperazines, phenolic compounds, phthalides, pyrazines, pyrrololactones and cyclic pentapeptides. Among the 40 substances identified, 11 are unpublished: botryosphthalide A (04), botryospyrazine A (05), botryosarin A (06), botryosphaerin J (07), botryosarin B (08), botryosphaerin K (09), botryosphaerin L (20), 4-hydroxyterpestacin (21), botryosbenzofuranone A (26), botryosbenzenediol A (28) and botryosbenzenediol B (32). The study of the co-culture of endophytes was carried out in malt ext. and at the end of fermentation period the fermented broth was subjected to three liq.-liq. partition with AcOEt, and the extract was generated after evaporation of the organic solvent. The analysis of the extract via HPLC-MS indicated the production of 13 substances that were no detected in monocultures, and of these, eight did not present records in four databases (massBank, Metlin, GNPS and Dictionary of Natural Products), being considered unpublished, but still to be identified. The studies related to B. parva and P. stromaticum aim to verify their metabolic production against different stimuli, as well as to evaluate the biological potential of the extracts, in the antibacterial, anti-glycation, antioxidant, antifungal, anticholinesterase and cytotoxic assays, in which the extracts of B. parva showed anticholinesterase, antifungal and cytotoxic activities, and the P. stromaticum extract showed antioxidant, cytotoxic and antiglicant activities.