Investigação de estratégias biotecnológicas no melhoramento do arsenal enzimático termoestável de Thermoascus aurantiacus CBMAI 756

Abstract

Fungos são considerados fontes promissoras de coquetéis enzimáticos atuando eficientemente na desconstrução de biomassas lignocelulósicas e na geração de açúcares fermentescíveis que podem ser fermentados a vários bioprodutos diferentes como, bioetanol, ácidos orgânicos, biocombustíveis, entre outros. O objetivo principal deste trabalho foi abordar varias estratégias biotecnológicas afim de estudar, avaliar e propor melhorias na performance de coquetéis enzimáticos termófilos, visando o aumento da sacarificação de bagaço de cana-de-açúcar. Neste contexto, o trabalho foi sub-dividido em 4 partes principais. Na primeira parte, inicialmente foi avaliada a produção enzimática em fermentação submersa dos fungos Thermoascus aurantiacus CBMAI 756 (TA) comparado a duas novas cepas fúngicas termofílicas identificadas como Rasamsonia emersonii COQ e Rasamsonia composticola FMG6. Estas cepas termofílicas foram individualmente cultivadas em uma mistura de bagaço de cana-de-açúcar, palha de milho e farelo de trigo. O repertório completo de CAZymes secretadas por estas cepas foi analisado por metodologia de espectrometria de massas (LC/MS). Na segunda parte do trabalho, foram realizadas combinações variadas do coquetel enzimático de TA com os coquetéis enzimáticos por R. emersonii COQ, R. composticola FMG6 e coquetel comercial CELLIC® CTec2. As melhores combinações foram utilizadas para ensaios de sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar BIN, pré-tratado com método alcalino (BD) e pré-tratado hidrotérmico sem separação de licor (Slurry), o que demonstrou um grande potencial das enzimas de TA em melhorar a liberação de glicose e xilose. Este estudo foi o primeiro a caracterizar, avaliar, e aplicar o coquetel da espécie termofílica R. composticola, que demonstrou ser uma fonte de enzimas eficientes para a sacarificação de bagaço de cana-de-açúcar. Após a análise do conteúdo genômico e proteico do potencial aresenal enzimático de TA, foram detectadas a ausência de enzimas importantes para a desconstrução eficiente de biomassa. Neste sentido, na tentativa de abordar estratégias biotecnológicas importantes de otimização do coquetel termofílico de TA, nas duas seções finais deste trabalho, foram realizadas a suplementação de forma “ex-situ” de enzimas recombinantes específicas nos bagaços de cana-de-açúcar pré-tratados. Nesta etapa foram escolhidas, a endoglucanase GH12 da linhagem 11AG8 de Streptomyces sp., a lacase (CotA) de Bacillus subtilis e diversas GH11 para a suplementação do coquetel enzimático de TA. A endoglucanase GH12 mostrou-se eficaz em aumentar a liberação de 5% de glicose utilizando BD. Enquanto a enzima Lacase CotA se destacou por aumentar da produção tanto de glicose como xilose na sacarificação dos dois tipos de bagaços avaliados (BD e Slurry). O maior aumento utilizando Lacase recombinante ocorreu no bagaço Slurry, com um acréscimo de 27% para glicose e 9,42%. para xilose. Devido às características importantes como a superioridade de atividade hemicelulásica de TA pela presença em abundância de endo-xilanase (GH10) e sua provável sinergia com GH11, ausente no genoma e secretoma desta espécie, o trabalho foi dividido em uma última parte que descreve a avaliação de diversas GH11 recombinantes destinadas a suplementação do arsenal enzimático de TA. Dentre as GH11 avaliadas destacou-se a mutante termoestável XAT M12 que provocou um aumento de 16,5% na liberação de xilose após a sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar BD. Nosso trabalho pode ser considerado o pioneiro no melhoramento por suplementação do potencial coquetel de TA utilizando enzimas recombinantes. Assim, destaca-se que estes resultados obtidos possivelmente deverão nortear o desenvolvimento de um melhor pipeline de avaliação e melhoramento de coquetéis enzimáticos para a sacarificação de biomassas lignocelulósicas produzidos pelo fungo T. aurantiacus entre outros.

Fungi are considered promising sources of enzymatic cocktails that act efficiently in the deconstruction of lignocellulosic biomass and in the generation of fermentable sugars that can be fermented to several different bioproducts, such as bioethanol, isolates, biofuels, among others. This study aimed to investigate several biotechnological strategies to evaluate and propose improvements in the performance of thermophilic enzymatic cocktails, aiming to advance the saccharification process of the sugarcane bagasse. In this context, this study was divided into four main parts. In the first part, we initially investigated the enzymatic production in submerged fermentation of the fungi species Thermoascus aurantiacus CBMAI 756 (TA) compared with two new thermophilic fungal strains, referred to the Rasamsonia emersonii COQ and Rasamsonia composticola FMG6. The strains were individually cultivated in a mixture of sugarcane bagasse, corn straw, and wheat bran. The complete CAZyme repertoire secreted by these strains was investigated through mass spectrometry (LC/MS). On the second part of this study, several combinations of the enzymatic TA cocktail with the cocktails produced by R. emersonii COQ, R. composticola FMG6 and the commercial cocktail CELLIC® CTec2. The best combinations were used for BIN sugarcane bagasse saccharification assays, pre-treated with alkaline method (BD) and hydrothermal pretreatment without liquor separation (Slurry), which demonstrated a great potential of TA enzymes in improving glucose and xylose release. This study was the first to characterize, evaluate, and apply the cocktail of the thermophilic species R. composticola, which demonstrated considerable potential as a source of new efficient enzymes used for saccharification of the sugarcane bagasse. After analyzing the genomic and protein content of the enzymatic aresenal potential of TA, the absence of important enzymes for the efficient deconstruction of biomass was detected. In this sense, by aiming to employ biotechnological approaches to optimize thermophilic cocktails, in the final sections of this study, we investigated the ex situ supplementation of specific recombinant enzymes. In this stage, the endoglucanase GH12 from Streptomyces sp. Strain 11AG8, the laccase (CotA) from Bacillus subtilis and several GH11 were chosen for supplementation of the TA enzyme cocktail. The endoglucanase GH12 efficiently improved the liberation of 5% of glucose using BD. On the other hand, the Laccase CotA enzyme improved glucose and xylose production in the saccharification of both investigated bagasse (BD and Slurry). The highest increase using the recombinant Laccase occurred in the Slurry bagasse, with an increase of 27% of glucose and 9,42% for xylose. Due to the important features such as the superiority of the hemicelullase activity of TA as a consequence of a single type of endoxylanase (GH10) and its presumable synergy with GH11, our final study evaluated several recombinant GH11 that were allocated to supplement the enzymatic arsenal of TA. Between the investigated GH11, the stable mutant XAT M12 stood out from our analyses because it provoked an increase of 16,5% in the xylose liberation after saccharification of the BD bagasse. Our work can be considered the pioneer in improving by supplementing the potential cocktail of TA using recombinant enzymes. In this manner, we highlight that our findings may direct the development of pipelines to evaluate and improve enzymatic cocktails for the saccharification of lignocellulosic biomass produced by the fungus T. aurantiacus and others.