Bioatividade dos ácidos retinoico e ascórbico e carregamento em hidrogel termossensível sintético para regeneração endodôntica

Abstract

Este estudo avaliou o potencial do ácido ascórbico (AA) e do ácido retinoico (AR) isolados e associados a hidrogéis de Pluronic F-127 (P) e colágeno (Col) para potencial aplicação para procedimentos de regeneração endodôntica. Células da papila apical humana (hAPCs) foram obtidas de terceiros molares humanos hígidos (N=4) e caracterizadas por citometria de fluxo. No Estudo 1, foi investigado o efeito bioativo dose-reposta do AR e AA sobre hAPCs. Os seguintes grupos experimentais foram estabelecidos: controle negativo – CN (α-MEM), controle veículo – CV (α-MEM + 0,17% DMSO), AR 0,1, 1 e 10 µM e AA 3, 30 e 300 µM (n=8). Foram realizados ensaios de viabilidade (alamarBlue, 1, 3 e 7d), formação de matriz mineralizada (Alizarin Red, 14d), síntese de colágeno total (Sirius Red, 1 e 7d) e expressão de genes relacionados à regeneração endodôntica (RT-qPCR, 1d e 7d). No Estudo 2, hidrogéis de P foram formulados e testados quanto à citocompatibilidade com hAPCs. Hidrogel de colágeno (Col) foi utilizado como controle positivo e testados hidrogéis de P (%m/v) P15%, P17,5%, P20%, P22,5%, P25% e P30% (n=8). As células foram cultivadas sobre ou sob hidrogéis recém-preparados ou armazenados por 4 meses e a viabilidade foi avaliada após 1, 3 e 7d, (alamarBlue e Live/Dead). No Estudo 3, AR 0,1 µM e AA 300 µM foram incorporados, isolados ou associados, ao hidrogel P25% e ao hidrogel de Col. Os grupos experimentais (n=10): Col, Col+AA, Col+AR, Col+AA+AR, P25%, P25%+AA, P25%,+AR, P25%+AA+AR foram avaliados em cocultura de hAPCs com células endoteliais (HUVECs) quanto à viabilidade celular (alamarBlue, 1, 3 e 7d), formação de matriz mineralizada (Alizarin Red, 14d), síntese de colágeno total (Sirius Red, 7 e 14d), migração celular ativa (Transwell, 1d), todos por contato indireto. A expressão de genes relacionados a regeneração endodôntica (RT-qPCR, 1d) foi avaliada inserindo os biomateriais em segmentos radiculares de incisivos bovinos para avaliação da regeneração pulpar in situ (n=6). Os dados foram analisados com testes t, ANOVAs e pós-testes específicos (α=5%). AR 10 µM apresentou citotoxicidade para hAPCs. AA 300 µM aumentou a viabilidade celular, síntese de colágeno total e formação de matriz mineralizada. AR 0,1 µM e AA 300 µM exerceram maior efeito sobre a modulação de genes relacionados à produção de matriz extracelular, angiogênese e quimiotaxia. O cultivo sobre o hidrogel aumentou a viabilidade em 1 e 3d, enquanto o cultivo sob o hidrogel aumentou a viabilidade em 1d e reduziu após 7d para todas as concentrações. A citocompatibilidade das hidrogéis armazenados por 4 meses foi semelhante à dos hidrogéis recém-preparados, exceto para P30%. Col+AA, Col+AR e Col+AA+AR aumentaram a viabilidade celular. P25%+AR aumentou a síntese de colágeno total e P25%+AA+AR aumentou a formação de matriz mineralizada. No modelo in situ, modulação da expressão gênica foi observada para Col+AA, Col+AR, PL25%+AR+AA e P25%+AR. Foi concluído que AR 0,1 µM e AA 300 µM bioestimularam hAPCs e a associação dessas moléculas a hidrogéis de P ou Col resultou em biomateriais com potencial aplicação para procedimentos de regeneração endodôntica.

This study evaluated the potential of ascorbic acid (AA) and retinoic acid (RA) alone and associated with Pluronic F-127 (P) and collagen (Col) hydrogels for potential application in endodontic regeneration procedures. Human apical papilla cells (hAPCs) were obtained from healthy human third molars (N=4) and characterized by flow cytometry. First, the dose-response bioactive effect of RA and AA on hAPCs was investigated. The following experimental groups were established: negative control - CN (α-MEM), vehicle control - CV (α-MEM + 0.17% DMSO), RA 0.1, 1 and 10 µM and AA 3, 30 and 300 µM (n=8). Cell viability (alamarBlue, 1, 3, and 7d), mineralized matrix formation (Alizarin Red, 14d), total collagen synthesis (Sirius Red, 1 and 7d), and the expression of genes related to endodontic regeneration (RT-qPCR, 1d and 7d) were evaluated. P-hydrogels were then formulated and tested for cytocompatibility with hAPCs. Collagen hydrogel (Col) was used as a positive control and P hydrogels (%m/v) P15%, P17.5%, P20%, P22.5%, P25% and P30% were tested (n=8). Cells were seeded on or under fresh or 4 months stored hydrogels, and viability was assessed (alamarBlue and Live/Dead; 1, 3, and 7d,). Finally, AR 0.1 µM and AA 300 µM were incorporated, alone or in combination, into the P25% hydrogel and the Col hydrogel. The experimental groups (n=10) Col, Col+AA, Col+RA, Col+AA+RA, P25%, P25%+AA, P25%,+RA, P25%+AA+RA were evaluated in coculture of hAPCs with endothelial cells (HUVECs) for cell viability (alamarBlue, 1, 3 and 7d), mineralized matrix formation (Alizarin Red, 14d), total collagen synthesis (Sirius Red, 7 and 14d), active cell migration (Transwell, 1d), all by indirect contact. Expression of genes related to endodontic regeneration (RT-qPCR, 1d) was evaluated by inserting the biomaterials into bovine root segments to assess pulp regeneration in situ (n=6). Data was analyzed using t-tests, ANOVAs and specific post-hocs (α=5%). AR 10 µM showed cytotoxicity for hAPCs. AA 300 µM increased cell viability, total collagen synthesis, and mineralized matrix formation. RA 0.1 µM and AA 300 µM had a greater effect on the modulation of genes related to extracellular matrix production, angiogenesis, and chemotaxis. hAPCs seeding on the hydrogel increased viability at 1 and 3d, while seeding under the hydrogel increased viability at 1d and decreased it after 7d for all concentrations. The cytocompatibility of hydrogels stored for 4 months was comparable to that of freshly prepared hydrogels, except for P30%. Col+AA, Col+RA, and Col+AA+RA increased cell viability. P25%+AR increased total collagen synthesis and P25%+AA+AR increased mineralized matrix formation. In the in situ model, modulation of gene expression was observed for Col+AA, Col+RA, PL25%+RA+AA and P25%+RA. It was concluded that AR 0.1 µM and AA 300 µM biostimulated hAPCs and the association of these molecules with P or Col hydrogels resulted in biomaterials with potential application in endodontic regeneration procedures.