Avaliação do biofilme de Paracoccidioides brasiliensis mono e multi espécie para o estudo da paracoccidioidomicose oral e de novos antifúngicos

Abstract

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica que afeta, primariamente, os pulmões, com envolvimento da cavidade oral, onde Candida albicans existe como comensal. O objetivo deste trabalho foi desenvolver esferoide de queratinócitos para avaliar a infecção por células planctônicas e de biofilme de Paracoccidioides brasiliensis (Pb18) monoespécie e misto com Candida albicans para o estudo da paracoccidioidomicose oral, bem como o tratamento com novo composto. Foi também estudada a expressão de genes relacionados a virulência dos dois microrganismos nas condições do estudo. A superfície onde houve maior formação de biomassa para todos os biofilmes foi a membrana de nitrocelulose, demonstrado tanto metabolicamente quanto estruturalmente. Quanto à resina acrílica, o biofilme misto de pré-formação demonstrou maior atividade metabólica e biomassa. Imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) revelaram biofilmes densos e aderentes, compostos por uma rede de interação isoladamente e entre os dois fungos. Foi obtido um modelo tridimensional (3D) de mucosa oral funcional e estável, a partir de células NOK-si, em densidade de 6x104 células/poço, capaz de reproduzir in vitro, interações complexas entre P. brasiliensis e C. albicans. O modelo 3D manteve morfologia e viabilidade celular ao longo de sete dias, suportando colonização fúngica, o que possibilita o uso como ferramenta experimental adequada para estudos da interação patógeno-hospedeiro e avaliação de terapias antifúngicas. A MEV demonstrou a interação de blastoconídios de ambas as espécies com o modelo 3D, indicando adaptações que favorecem a colonização e a formação de biofilmes, a partir de células planctônicas. A análise genômica do biofilme de P. brasiliensis revelou expressão aumentada de genes relacionados à adesão, metabolismo e modulação da parede celular. Já C. albicans manteve o gene produtor de candidalisina, uma toxina peptídica, sob alta expressão em todas as condições experimentais. Na infecção do modelo tridimensional, os genes PbGP43 e ECE1 mantiveram-se altamente expressos, sugerindo papel relevante na coinfecção e potencial como alvos terapêuticos. Os modelos in vivo de Danio rerio e G. mellonella foram úteis para pré-selecionar substâncias que podem seguir na busca de novos antifúngicos. Esses achados contribuíram para a compreensão dos mecanismos de colonização e coinfecção oral na PCM, fornecendo base para o desenvolvimento e avaliação para novas substâncias antifúngicas em condições inerentes à interação patógeno-hospedeiro.

Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis that primarily affects the lungs and may also involve the oral cavity, where Candida albicans is commonly found as a commensal. This study aimed to develop keratinocyte spheroids to evaluate the infection of planktonic and biofilm cells of Paracoccidioides brasiliensis (Pb18), either as a monospecies or in combination with Candida albicans, for the investigation of oral paracoccidioidomycosis, as well as treatment with a novel compound. The expression of virulence-associated genes in both microorganisms was also analyzed under the experimental conditions. Among the tested substrates, nitrocellulose membranes supported the highest biomass formation for all biofilms, as demonstrated both metabolically and structurally. On acrylic resin, preformed mixed biofilms displayed greater metabolic activity and biomass. Scanning electron microscopy (SEM) images revealed dense, adherent biofilms, composed of an interaction network within and between the two fungi. A functional and stable three-dimensional (3D) oral mucosa model was established from NOK-si cells at a density of 6x104 cells/well, capable of reproducing in vitro complex interactions between P. brasiliensis and C. albicans. The 3D model maintained morphology and cell viability over seven days, supporting fungal colonization, and thus served as a suitable experimental tool for pathogen–host interaction studies and evaluation of antifungal therapy. SEM analysis revealed interactions between blastoconidia from both species and the 3D model, indicating adaptive responses that promote colonization and biofilm formation from planktonic cells. Genomic analysis of P. brasiliensis biofilms revealed an increase in the expression of genes associated with adhesion, metabolism, and cell wall remodeling. C. albicans consistently maintained high expression of the gene encoding candidalysin, a peptide toxin, under all experimental conditions. During the infection of the 3D model, the PbGP43 and ECE1 genes remained highly expressed, suggesting a significant role in co-infection and potential as therapeutic targets. In vivo models using Danio rerio and Galleria mellonella have proven helpful for pre-screening candidate compounds for antifungal development. Collectively, these findings advance the understanding of oral colonization and co-infection mechanisms in PCM and provide an experimental foundation for the development and assessment of novel antifungal agents under conditions that closely mimic pathogen-host interactions.