Desenvolvimento de biossensor capacitivo para diagnóstico da dengue

Abstract

Dengue fever is a neglected disease that affects the population of many tropical regions around the globe, including Brazil. This disease is transmitted through the bit of infected Aedes aegypti mosquito. The diagnosis of Dengue can be made using two different methodologies: reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), which uses RNA to identify the virus, or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), that detects antibodies and/or antigens. Both methods are expensive and have high technical complexity, as well as intrinsic challenges for miniaturization. Such characteristics impose difficulties for mass population tests, which is an important step to control the spread of infectious diseases. Consequently, new bioanalytic methods emerge as potential tools for diagnosis. Among such methods, capacitive based biosensors are receiving more and more attention since they allow the development of a sensible, portable and easy methodology for diagnosis. In this context, this work goals to develop an electrochemical capacitive based methodology able to detect the non-specific protein of dengue (NS1), a protein biomarker for Dengue. Gold coated silicon wafer was used as electrode, and different cleaning protocols were assessed aiming to immobilize the ferrocene (Fc) modified peptide Fc-Glu-Ala-Ala-Cys-NH2 (pep-Fc) for redox capacitance biosensing. The bare surface as well as the modified gold surfaces were characterized using cyclic voltammetry (CV) and electrochemical impedance spectroscopy (EIS). The cleaning procedure which yields more compact self-assembled monolayers (SAMs) comprises ultrasonic bath using a sequence of different organic solvents (isopropyl alcohol and acetone), and ultrapure water, followed by UV/Ozone. Using this cleaning protocol, the pep-Fc modified surface presented a capacitance of about 180 µF/cm2. The sensor surface was designed by immobilizing Anti-NS1 antibody (biological receptor) over the pep-Fc modified electrode by EDC/NHS protocol, followed by blocking step with SuperBlockTM (PBS). This system was able to detect selectively NS1 protein in the concentration of 1 µg/mL in phosphate buffer, with a 3% cutoff (95% of confidence interval), using the inverse of the electrochemical capacitance (i.e. 1/𝐶������µ ) as signal transduction. Further studies in complex biological media, such human serum, will be performed in future works, but this study demonstrates the potential use of electrochemical capacitance-based methodology for Dengue diagnosis.

A dengue é uma doença negligenciada que afeta severamente a população de diversas regiões de clima tropical ao redor do mundo, incluindo o Brasil. Essa doença é transmitida por meio da picada do mosquito Aedes aegypti infectado pelo vírus da dengue (DENV1-4). O diagnóstico da dengue pode ser realizado por duas abordagens diferentes, a Transcrição Reversa seguida de Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR), que identifica a presença de RNA do vírus, ou pelo ensaio de imunoadsorção enzimático (ELISA), que detecta a presença de anticorpos e antígenos relacionados à doença. Como esses métodos são onerosos, necessitam de pessoal treinado para execução, e apresentam desafios técnicos para o desenvolvimento de metodologias portáteis, ideais para a testagem em massa da população de forma rápida, novos métodos bioanalíticos são necessários. Entre esses métodos, os biossensores capacitivos têm recebido destaque uma vez possibilitam o desenvolvimento de abordagens sensíveis, portáteis e de simples utilização. Nesse contexto, este trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de uma abordagem eletroquímica capacitiva capaz de detectar a proteína não-específica 1 (NS1), uma espécie biomarcadora para o diagnóstico da dengue. Como superfície transdutora de sinal de reconhecimento biológico, utilizou-se wafer de silício revestido com ouro, posteriormente modificada com peptídeo modificado com ferroceno (Fc) Fc-Glu-Ala-Ala-Cys-NH2. Como etapa inicial da construção do biossensor, realizou-se diferentes procedimentos de limpeza da superfície de ouro, seguidos de caracterização eletroquímica por voltametria cíclica (VC) e espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS). O procedimento de limpeza que obteve monocamada automontada de peptídeo com maior estabilidade ao longo do tempo é realizado por sucessivas lavagens com solventes orgânicos (álcool isopropílico, acetona) e água ultrapura em banho ultrassônico, seguido de UV/ozônio. Utilizando esse protocolo, o peptídeo eletroativo foi quimicamente adsorvido sobre o eletrodo, culminando numa superfície eletroativa com capacitância eletroquímica (C) de aproximadamente 180 μF/cm2. Como espécie de reconhecimento biológico, anticorpo anti-NS1 foi imobilizado sobre o eletrodo por meio do protocolo EDC/NHS, bloqueando os sítios remanescente com SuperBlockTM (PBS). Por meio dessa superfície e utilizando o inverso do sinal de capacitância (i.e. 1/𝐶����������������μ) como sinal transdutor, foi possível detectar com sucesso a proteína NS1 na concentração 1 μg/mL, com cutoff de 3% (intervalo de confiança de 95%). O valor do sinal de transdução utilizando a proteína BSA como espécie não-específica ficou abaixo de 3%, evidenciando que a superfície reconhece de forma seletiva a proteína NS1. Os resultados desse trabalho demonstram a potencialidade da abordagem eletroquímica capacitiva no desenvolvimento de testes qualitativos (i.e. resultado positivo/negativo) para a dengue e, portanto, como potencial ferramenta para o diagnóstico dessa doença.