Clonagem e expressão de fragmentos de anticorpos (scFV) contra o vírus da leucemia felina (FeLV) por phage display

Abstract

O vírus da leucemia felina (FeLV) é um retrovírus que infecta principalmente gatos jovens. Em aglomerados de animais, a infecção pelo FeLV é a que mais contribui para a mortalidade. O emprego de técnicas moleculares de detecção viral permitiu avanços no que diz respeito à caracterização da patogenia e resposta à vacinação. Baseando-se nesses novos resultados, o diagnóstico da infecção deve ser realizado, primeiramente, com um teste de triagem de detecção da proteína de capsídeo p27, e, posteriormente, a confirmação com teste de detecção de DNA proviral. O diagnóstico e separação de animais positivos constituem o mecanismo primordial para conter a disseminação do FeLV. Diante disso, é de grande importância facilitar o acesso e baratear o diagnóstico. A construção de um teste de detecção da p27 baseia-se na produção de anticorpos monoclonais. A técnica de hibridomas é menos prática e demanda mais tempo para a obtenção de resultados satisfatórios quando comparada à técnica de Phage Display. Esta está em franco desenvolvimento e tem ganhado grande aplicabilidade na medicina veterinária. Empregamos o sistema de Phage Display desenvolvido por Krebber e colaboradores (1997). Primeiramente, foi construída uma biblioteca imune em camundongos, em seguida, foram amplificadas as regiões gênicas variáveis das cadeias leve (VL) e pesada (VH) e ligadas com um Linker de (Gli4Ser)4. Esses fragmentos geneticamente construídos derivados de anticorpos são denominados de single chain variable fragment ou scFv. Os scFvs foram fusionados à pIII e apresentados na superfície de fagos filamentos. Após três ciclos de seleção e enriquecimento contra a p27 recombinante produzida no laboratório, onze scFvs foram selecionados e caracterizados com relação à constituição nucleotídica e de aminoácidos. Dentre eles, o scFv 9 e scFv 70 foram escolhidos...

The feline leukemia virus (FeLV) is a retrovirus that infects primarily young cats. In animal clusters, FeLV infection is the largest contributor to mortality. The use of molecular techniques for viral detection has allowed advances with regard to the pathogenicity and response to vaccination. Based on these new findings, the diagnosis of infection should be performed first, with a screening test for detection of p27 capsid protein, and subsequently confirmed with testing for proviral DNA. The diagnosis and segregation of positive animals is the primary mechanism to contain the FeLV spread. Therefore, it is of great importance to facilitate access and lower the diagnosis. The construction of a test for p27 detection relies on monoclonal antibody development. The hybridoma technique is less practical and more time consuming to obtain satisfactory results when compared to Phage Display technology. The latter has been improved rapidly and has gained wide application in veterinary medicine. We employed the Phage Display system developed by Krebber et al. (1997). First, an immune library was built in mice and the variable region of the light and the heavy genes were amplified and connected by a linker of (Gly4Ser)4. This genetically engineered antibody fragments are called single chain variable fragments or scFv. The scFvs were fused to the pIII protein and displayed on the surface of filamentous phages. After three rounds of selection and enrichment against recombinant p27 (produced in the laboratory), eleven scFvs were selected and characterized with respect to nucleotide and aminoacid composition. Among them, scFv 9 and scFv 70 were chosen for subcloning and expression in prokaryotic system for production of heterologous proteins. The scFvs in soluble forms were evaluated for their binding capacity to p27. The scFvs will be employed to the development of an immunoassay for FeLV detect... (Complete abstract click electronic access below)