Potencial odontogênico de scaffolds de nanofibras incorporados com diferentes fases minerais sobre células pulpares humanas

Abstract

Scaffolds de nanofibras têm se destacado para a regeneração de tecidos craniofaciais, especialmente quando associados a moléculas bioativas capazes de estimular a neoformação de tecidos duros. Entretanto, o potencial odontogênico sobre células pulpares necessita ser melhor investigado, para que seja possível o desenvolvimento de biomateriais para utilização como capeadores pulpares diretos. Portanto, esse estudo foi dividido em duas fases: a primeira avaliou a incorporação de diferentes fases minerais contendo cálcio, fosfato ou ambos em scaffolds de nanofibras e a bioatividade em células pulpares humanas (HDPCs); a fase 2 teve como objetivo caracterizar scaffolds incorporados com hidróxido de cálcio (HC) quanto à solubilidade e liberação de cálcio, bem como a expressão de genes marcadores da diferenciação odontogênica por HDPCs em contato com o biomaterial. Soluções de PCL (policaprolactona; 10% m/v) foram incorporadas ou não com hidróxido de cálcio (PCL+HC), nano-hidroxiapatita (PCL+nHA), ou β-glicerofosfato (PCL+βGF) (todas 0,5% m/v) para confecção de scaffolds de nanofibras por meio de eletrofiação. Morfologia (diâmetro das fibras e espaços interfibrilares) e incorporação da fase mineral foram analisados por MEV/EDS. HDPCs foram semeadas sobre os scaffolds e avaliadas quanto à viabilidade (alamarBlue e Live/Dead) em 1, 7 e 14 dias; adesão e espalhamento (F-actina) em 1, 3 e 7 dias; e formação de matriz mineralizada (Alizarin Red) após 21 dias. Para a segunda fase do projeto, os scaffolds incorporados com 0,5% de HC foram confeccionados e avaliados quanto à solubilidade e liberação de cálcio. A expressão gênica foi avaliada por RT-qPCR aos 7 e 14 dias de cultura de HDPCs semeadas sobre a superfície dos scaffolds. Os dados foram analisados com ANOVA complementada por Sidak, Tukey ou Games-Howell (α=5%). A incorporação de HC aumentou o diâmetro das nanofibras e a porcentagem de espaços interfibrilares, enquanto βGF reduziu ambos e nHA não teve efeito sobre esses parâmetros. Aumento significativo da viabilidade, adesão, espalhamento e deposição de matriz mineralizada por HDPCs foi observada para as formulações PCL+HC e PCL+nHA, com destaque para a primeira, que aumentou em torno de 9× o potencial de mineralização. Os scaffolds incorporados com HC demonstraram um padrão de degradação lento nos primeiros 6 meses, porém mais rápido que o controle sem incorporação, com liberação de cálcio significativa nos primeiros 140 dias. Em conclusão, a incorporação de HC e nHA em nanofibras de PCL permitiu a obtenção de scaffolds citocompatíveis favoráveis para adesão, proliferação e deposição de matriz mineralizada por HDPCs. Scaffolds incorporados com 0,5% de HC apresentaram um perfil de degradação lento com liberação de cálcio constante que foi capaz de estimular células pulpares humanas a aumentar a expressão de genes marcadores da odontogênese, sendo estratégias bioativas promissoras para aplicação sobre o tecido pulpar exposto.

Nanofiber scaffolds have been highlighted for the regeneration of craniofacial tissues, especially when associated with bioactive molecules capable of stimulating the neoformation of hard tissues. However, the odontogenic potential on pulp cells needs to be better investigated, to guide the development of biomaterials for use as direct pulp capping devices. Therefore, this study was divided into two phases, the first evaluated the incorporation of different mineral phases containing calcium, phosphate or both in nanofiber scaffolds and the bioactivity in human pulp cells (HDPCs). The second phase aimed to characterize scaffolds incorporated with calcium hydroxide (CH) in terms of solubility and calcium release, as well as the expression of genes of odontogenic differentiation by HDPCs in contact with the biomaterial. Polycaprolactone solutions (PCL; 10% w/v) were incorporated or not with calcium hydroxide (PCL+HCH), nano-hydroxyapatite (PCL+nHA), or β-glycerophosphate (PCL+βGF) (all 0.5% m/v) used to produce nanofiber scaffolds by electrospinning. Morphology (fiber diameter and interfibrillar spaces) and mineral phase incorporation were analyzed by SEM/EDS. HDPCs were seeded on the scaffolds and evaluated for viability (alamarBlue and Live/Dead) at 1, 7 and 14 days; adhesion and spread (F-actin) at 1, 3 and 7 days; and mineralized matrix formation (Alizarin Red) after 21 days. For the second phase of the project, scaffolds incorporated with 0.5% CH were made and evaluated for solubility and calcium release. Gene expression was evaluated by RT-qPCR at 7 and 14 days of culture of HDPCs seeded on the surface of the scaffolds. Data were analyzed with ANOVA complemented by Sidak, Tukey or Games-Howell (α=5%). The incorporation of CH increased the nanofiber diameter and the percentage of interfibrillar spaces, while βGF reduced both and nHA had no effect on these parameters. A significant increase in the viability, adhesion, scattering and deposition of mineralized matrix by HDPCs was observed for the PCL+CH and PCL+nHA formulations, with emphasis on the former, which increased the mineralization potential by around 9×. Scaffolds incorporated with CH showed a slow degradation pattern in the first 6 months, but faster than the control without incorporation, with significant calcium release in the first 140 days. In conclusion, the incorporation of HC and nHA in PCL nanofibers allowed obtaining cytocompatible scaffolds favorable for adhesion, proliferation, and deposition of mineralized matrix by HDPCs. Scaffolds incorporated with 0.5% CH showed a slow degradation profile with constant calcium release that was able to stimulate human pulp cells to increase the expression of odontogenesis marker genes, being promising bioactive strategies for application on exposed pulp tissue.