Publicação: Peptídeos antimicrobianos e doença periodontal: influência do tabagismo na expressão de peptídeos antimicrobianos e possíveis efeitos de peptídeos sintéticos sobre biofilmes multi-espécies
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Data
2020-03-16
Autores
Orientador
Zandim-Barcelos, Daniela Leal 
Coorientador
Pós-graduação
Odontologia - FOAR
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Tese de doutorado
Direito de acesso
Acesso aberto
Resumo
Resumo (português)
Peptídeos antimicrobianos (PAMs) são importantes componentes da resposta do hospedeiro contra patógenos invasores. Além da ação antimicrobiana direta, podem também participar na modulação do sistema imune. No entanto, o papel dos PAMs na etiopatogênese da doença periodontal e os fatores de risco que podem influenciar sua expressão na cavidade bucal ainda não se encontram totalmente elucidados. Dessa forma, os objetivos do presente estudo foram: (1) avaliar a influência do tabagismo nos níveis de LL-37 e HNP 1-3 no fluido crevicular gengival (FCG) de pacientes com periodontite e investigar a associação entre os níveis destes PAMs e de mediadores inflamatórios nos sítios com ausência e presença de doença periodontal; (2) investigar o impacto do tabagismo nos níveis de hBD1 e 2 em pacientes com periodontite e avaliar os efeitos da nicotina e cotinina na expressão destes PAMs por queratinócitos; (3) avaliar a atividade metabólica e enzimática durante a recolonização de biofilmes multi-espécies periodontopatogênicos após tratamento com peptídeos sintéticos derivados da catelicidina humana (LL31 e D-LL31). A quantificação dos PAMs e mediadores inflamatórios no FCG foi realizada por meio de ensaio ELISA sanduiche e Multiplex, repectivamente, enquanto a RT-qPCR em tempo real detectou a expressão gênica dos PAMs por queratinócitos. A produção de ácido láctico foi mensurada para determinar a atividade metabólica nos biofilmes pós-tratamento, enquanto a atividade enzimática foi analisada por meio da dipeptidil peptidase (DPP). Além disso, a viabilidade celular foi avaliada pela contagem de unidades formadoras de colônia e o qPCR identificou a presença de P. gingivalis e a concentração de bactérias totais nos biofilmes. Os resultados dos estudos clínicos demonstraram que o tabagismo pode influenciar na expressão dos PAMs, reduzindo os níveis de LL-37, HNP 1-3 e hBD1 e aumentando os níveis de hBD2 no FCG. Nos sítios doentes, foram observados maiores níveis de LL-37 comparados aos sítios sadios, com associação positiva à presença de IL-1 e MMP-8. A HNP 1-3, por sua vez, apresentou níveis mais baixos, com associação positiva a IL-10. Nos experimentos in vitro, foi constatado que a nicotina reduz significativamente a expressão gênica de hBD1 por queratinócitos, sendo essa redução mais acentuada na presença de A. actinomycetemcomitans. Tanto a nicotina como a cotinina promoveram redução na expressão de hBD2 quando associadas à cultura bacteriana. No entanto, esta redução foi significativa apenas para o estímulo simultâneo com cotinina e P. gingivalis. Em relação ao efeito dos peptídeos sintéticos sobre a recolonização de biofilmes multi-espécies, os resultados indicam que o D-LL31 possui ação inibitória sobre a atividade metabólica e enzimática durante a recolonização de biofilme multi-espécies periodontopatogênico, podendo seu efeito se prolongar até 5 dias após o tratamento. Assim, podemos concluir que o efeito do tabagismo na expressão dos PAMs pode ser mais um mecanismo associado à maior prevalência e severidade de doença periodontal em fumantes. Além disso, o efeito inibitório do peptídeo sintético D-LL31 torna-o um possível agente terapêutico para utilização no tratamento da doença periodontal.
Resumo (inglês)
Antimicrobial peptides (AMPs) are important components of the host response against invading pathogens. In addition to the direct antimicrobial activity, they can also participate in the immune system modulation. However, the role of AMPs in the etiopathogenesis of periodontal disease and the risk factors that may influence their expression in the oral cavity are not yet fully understood. Thus, the purposes of the present study were: (1) to evaluate the influence of smoking on the levels of LL-37 and HNP 1-3 in the gingival crevicular fluid (GCF) of patients with periodontitis and to investigate the association between the levels of these AMPs and inflammatory mediators at sites with absence and presence of periodontal disease; (2) to investigate the impact of smoking on hBD1 and 2 levels in patients with periodontitis and to evaluate the effects of nicotine and cotinine on the expression of these AMPs by keratinocytes; (3) evaluate the metabolic and enzymatic activity during the recolonization of multi-species periodontopathogenic biofilms after treatment with synthetic peptides derived from human cathelicidin (LL31 and D-LL31). The quantification of AMPs and inflammatory mediators in the GCF was performed by sandwich ELISAs and Multiplex assay, respectively, while RT-qPCR in real time detected the gene expression of the AMPs by keratinocytes. The production of lactic acid was measured to determine the metabolic activity in post-treatment biofilms, while the enzymatic activity was analyzed using dipeptidyl peptidase (DPP). In addition, cell viability was assessed by counting colony-forming units and qPCR identified the presence of P. gingivalis and the concentration of total bacteria in biofilms. The results of clinical studies have shown that smoking can influence the expression of AMPs, reducing the levels of LL-37, HNP 1-3 and hBD1 and increasing the levels of hBD2 in the FCG. Higher levels of LL-37 were observed in diseased sites compared to healthy sites, with a positive association with the presence of IL-1 and MMP-8. Nevertheless, HNP 1-3 presented lower levels with positive association with IL-10. In in vitro experiments, it was found that nicotine significantly reduces the gene expression of hBD1 by keratinocytes, being this reduction more pronounced in the presence of A. actinomycetemcomitans. Both nicotine and cotinine reduced hBD2 expression when associated with bacterial culture. However, this reduction was significant only for the simultaneous stimulation with cotinine and P. gingivalis. Regarding the effect of synthetic peptides on the recolonization of multi-species biofilms, the results indicate that D-LL31 has an inhibitory action on the metabolic and enzymatic activity during the recolonization of periodontopathogenic multispecies biofilms, and its effect can be prolonged up to 5 days after treatment. Thus, we can conclude that the effect of smoking on the expression of AMPs may be one of the mechanisms associated with the higher prevalence and severity of periodontal disease in smokers. In addition, the inhibitory effect of the synthetic peptide D-LL31 makes it a possible therapeutic agent for use in the treatment of periodontal disease.
Descrição
Idioma
Português
