Efeitos de miR-BARTs do vírus de Epstein-Barr na modulação de vias de sinalização intracelular em células derivadas de linfomas humanos

Abstract

O linfoma de Burkitt (LB) é um linfoma não-Hodgkin de células B altamente agressivo, associado à infecção pelo vírus de Epstein-Barr (EBV) em virtualmente todos os casos de forma endêmica da doença. O EBV foi o primeiro vírus humano descoberto codificar miRNAs no genoma viral, agrupados em duas regiões distintas: BamHI fragment H rightward open reading frame 1 (miR-BHRFs) e BamHI-A rightward transcripts (miR-BARTs). Embora extensivamente estudado no contexto de neoplasias epiteliais, o papel dos EBV miR-BARTs na patogênese de linfomas associados à infecção pelo EBV é essencialmente desconhecido. Este estudo tem como objetivo investigar os efeitos da supressão dos EBV miR-BART7 e miR-BART9 em células Akata EBV-positivas através da edição dirigida do genoma viral por CRISPR/Cas9. Ambos os mutantes gerados apresentaram baixos níveis de expressão dos miRNAs virais, demonstrando a eficácia da edição mediada por CRISPR/Cas9. A supressão de ambos miRNAs nos mutantes acarretou em uma diminuição drástica de viabilidade e proliferação celular, levando ao aumento da expressão de genes líticos virais. A análise do perfil protêomico dos mutantes demonstrou que a supressão do EBV miR-BART7 aumentou a expressão de diversas proteínas de ligação de RNA, enquanto a supressão de miR-BART9 levou ao aumento da expressão de DNA topoisomerases e proteínas associadas a via ubiquitina-proteossoma. Nossos resultados demonstram importantes papéis e mecanismos associados a expressão de EBV miR-BART7 e miR-BART9 no aumento da proliferação celular e manutenção da latência viral, sequestrando vias celulares importantes associadas ao ciclo lítico viral.

Burkitt Lymphoma (BL) is a highly aggressive B-cell non-Hodgkin lymphoma associated with the Epstein-Barr virus (EBV) infection in virtually all cases of its endemic African form. EBV was the first human virus found to encode viral miRNAs, clustered in two distinct regions of the viral genome: the BamHI fragment H rightward open reading frame 1 (miR-BHRFs) and the BamHI-A rightward transcripts (miR-BARTs). Although extensively studied in epithelial cancers, the role of EBV miR-BARTs on the pathogenesis of EBV-associated lymphomas is essentially unknown. Therefore, this study sought to investigate the effects of EBV miRs BART7 and BART9 suppression in Akata EBV-positive cells using CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis. Overall, both Akata mutants harboring the edited EBV genomes exhibited low levels of viral miRNAs expression, demonstrating the efficacy of the CRISPR/Cas9-mediated knockdown of EBV miR-BART7 and 9. A reduction in cell viability, proliferation, and increased expression of viral lytic genes was found in both mutants. The knockdown of EBV miR-BART7 significantly increased the expression of several RNA binding proteins (RBPs), while the knockdown of EBV miR-BART9 increased the expression of DNA topoisomerases and ubiquitin/proteasome proteins. Our results unravel potential roles for EBV miR-BART7 and miR-BART9 increasing cell proliferation and maintaining viral latency by hijacking critical cellular pathways associated with the viral lytic cycle.