Desenvolvimento de uma nanopartícula de quitosana contra o biofilme misto de Paracoccidioides brasiliensis e klebsiella pneumoniae e avaliação toxicológica em modelos alternativos

Abstract

As micoses invasivas são as formas mais graves das infecções fúngicas e estima-se que cerca de 150 milhões de pessoas são acometidas. A paracoccidioidomicose PCM é considerada a segunda micose sistêmica mais prevalente na América Latina sendo que o Brasil concentra 80% dos casos e é uma doença sistêmica que acomete principalmente os pulmões. Tem como agente etiológico o complexo Paracoccidioides spp. Esta doença pode ocorrer principalmente em pacientes imunodeprimidos e pode se associar em comorbidades como é o caso da associação com Klebsiella pneumoniae (Kp), bactéria Gram negativa responsável pelas infecções do trato respiratório inferior (ITRI) como em casos de pneumonias, fibrose cística e bacteremias causando 2 milhões de mortes no mundo todo. Estes microrganismos presentes na coinfecção possuem habilidade de se adaptar a mudanças do meio ambiente, fundamental para sua sobrevivência principalmente na forma de biofilme misto e podem estabelecer comportamentos variáveis dependentes da associação. Diante do exposto este projeto tem como objetivo caracterizar pela primeira vez a formação do biofilme misto de Paracoccidioides brasiliensis (Pb18) e K. pneumoniae (Kp), assim como avaliar ação da nanopartícula de quitosana associada a um benzofuroxano ou não contra os biofilmes monoespécie e mistos. Os biofilmes monoespécie e mistos foram formados em duas condições de interação a primeira com previa formação de P. brasiliensis (Pb18) seguida da adição subsequente de K. pneumoniae (ATCC 10031), (Pb18+Kp) A segunda associação foi realizada com a interação simultânea dos microrganismos (Kp e Pb18). Após a caracterização dos biofilmes monoespecie e mistos foi realizado o screening de muitas moléculas, desta forma encontramos duas substâncias nitroimidazooxazina (IN8) e 3’hidroxichalcona (3’CH) que apresentaram um melhora na atividade antibiofilme. Demos continuidade com a 3’Chalc livre e incorporada NQ3’ esta nanopartícula mostrou estar dentro dos parâmetros da normalidade com 207nm, 0,39 PDI e potencial zeta de +27 demostrando estabilidade nas nanopartículas, o tamanho e morfologia da NQ foi corroborada pela microscopia de força atômica (AFM). A NQ3’ mostraram uma melhor atividade anti-biofilme contra os biofilmes monoespécie e mistos reduzindo a concentração inibitória do biofilme (CIB50), mostrando diferença significante quando comparado com o fármaco livre, principalmente nos biofilmes mistos conseguindo reduzir a atividade metabólica em até 71% o qual foi corroborada com a microscopia de varredura(MEV) demostrou que NQ3’CH uma alta atividade antibiofilme e que o NQ consegue entregar o fármaco de forma mais eficiente. Já na avaliação citotóxica a Formulação NQ3’CH reduz o efeito citotóxico da droga livre e a nanopartícula de quitosana (NQ) não mostrou efeito citotóxico em nehuma concentração avaliada. Estes resultados foram corroborados com os ensaios in vivo em Tenébrio molitor e onde a avaliação toxicológica mostrou que todas as formulações aumentam a sobrevivência da larva quando comparada com a droga livre e que os melhores resultados foram observados para NQ3’. Já no modelo zebrafish demostrou toxicidade em altas concentrações. Nossos resultados demostraram que NQ3’CH é uma formulação promissora para o tratamento dos biofilmes em estudo assim como das coifrcçoes destes pacientes entretanto modelos in vivo serão necessários para corroborar este resultados.