Cumarinas e hesperetina como candidatas antivirais contra o vírus Sincicial Respiratório Humano

Abstract

O vírus sincicial respiratório humano (hRSV) é um dos principais causadores de doenças respiratórias agudas que acomete principalmente crianças até os 2 anos e idosos, responsável por complicações como bronquiolite e pneumonia. Existem duas vacinas disponíveis, Arexvy® para idosos e a Abrysvo™ que pode ser administrada em gestantes. Em termos profiláticos, existem anticorpos monoclonais, como o Palivizumabe e o Nirsevimabe para pacientes pediátricos de alto risco, e como tratamento, um antiviral de amplo espectro, a Ribavirina, porém não existe medicamento específico. Dentre as proteínas codificadas pelo vírus, a nucleoproteína N destaca-se por sua importância na proteção do RNA viral e por sua atuação como molde para a replicação e transcrição viral. O reconhecimento eficiente e específico do molde NC pela polimerase é mediado pela fosfoproteína P. Isso deve-se à interação de resíduos do C-terminal da fosfoproteína em um bolso hidrofóbico no domínio N-terminal da nucleoproteína (N-NTD). O presente projeto realizou uma investigação da interação da cumarina, esculetina, esculina, 4-metil esculetina, umbeliferona com o N-NTD, e de competição com o undecapeptídeo (6FAM-DSDNDLSLEDF) via ressonância magnética nuclear e anisotropia de fluorescência. Realizamos ensaios de citotoxicidade e inibição viral das cumarinas e da hesperetina, nas células HEp-2, A549 e HBE (human bronchial epithelial) diferenciada. Os resultados de competição por STD-RMN das cumarinas com o undecapeptídeo pelo N-NTD da nucleoproteína mostraram que a cumarina compete pelo sítio, enquanto para as demais cumarinas observou-se um deslocamento e uma leve diminuição nos sinais, indicando que essas possam estar se ligando junto com undecapeptídeo no hotspot ou próximo a ele. Nas análises de anisotropia de fluorescência também foi observado competição da cumarina com o undecapeptídeo, pelo sítio N-NTD. A análise de perturbação de deslocamento químico do N-NTD na presença da cumarina mostra que os resíduos Lys46, Arg132, Tyr135 e His151, são resíduos do hotspot que apresentaram as variações mais significativas. Nos ensaios de inibição viral em células A549, a 4-metil, esculetina e hesperetina diminuíram a replicação viral, em 70, 89 e 50%, respectivamente. Quando encapsuladas com β - ciclodextrina, a cumarina, esculetina e hesperetina apresentaram ação inibitória contra o hRSV, especialmente nas células HBE diferenciadas. Concluímos que as cumarinas diminuíram a infecção viral em cultura celular e podem ter como alvo alguma proteína do ciclo replicativo do vírus, como a nucleoproteína. Porém são necessárias mais investigações para identificar o alvo celular ou viral dessas cumarinas, assim como realizar modificações químicas nessas moléculas fenólicas, que contribuam para o aumento da inibição contra o RSV e que diminuam seus efeitos tóxicos.

The human respiratory syncytial virus (hRSV) is one of the main causes of acute respiratory diseases that mainly affects children up to the age of 2 and the elderly, responsible for complications such as bronchiolitis and pneumonia. Two vaccines are available, Arexvy® for the elderly and Abrysvo™, which can be administered to pregnant women. In prophylactic terms, there are monoclonal antibodies, such as Palivizumab and Nirsevimab for high-risk pediatric patients, and as a treatment, a broad-spectrum antiviral, Ribavirin, but there is no specific drug. Among the proteins encoded by the virus, nucleoprotein N stands out for its importance in protecting viral RNA and acting as a template for viral replication and transcription. The efficient and specific recognition of the NC template by the polymerase is mediated by phosphoprotein P. This is due to the interaction of residues from the C-terminus of the phosphoprotein in a hydrophobic pocket in the N-terminal domain of the nucleoprotein (N-NTD). The present project investigated the interaction of coumarin, esculetin, esculin, 4-methyl esculetin, umbelliferone with the N-NTD, and competition with the undecapeptide (6FAM DSDNDLSLEDF) via nuclear magnetic resonance and fluorescence anisotropy. We carried out cytotoxicity and viral inhibition tests on coumarins and hesperetin in HEp-2, A549 and differentiated human bronchial epithelial (HBE) cells. The results of the STD-MRN competition of the coumarins with the undecapeptide for the N-NTD of the nucleoprotein showed that coumarin competes for the site, while for the other coumarins there was a displacement and a slight decrease in the signals, indicating that they may be binding together with the undecapeptide in the hotspot or close to it. Fluorescence anisotropy analyses also showed that coumarins competed with undecapeptide for the N-NTD site. The chemical shift perturbation analysis of the N-NTD in the presence of coumarin shows that residues Lys46, Arg132, Tyr135 and His151 are the hotspot residues that showed the most significant variations. In viral inhibition tests on A549 cells, 4-methyl, esculetin and hesperetin reduced viral replication by 70, 89 and 50%,respectively. When encapsulated with β-cyclodextrin, coumarin, esculetin and hesperetin showed inhibitory action against hRSV, especially in differentiated HBE cells. We concluded that coumarins reduced viral infection in cell culture and may have targeted some protein in the virus's replicative cycle, such as nucleoprotein. However, further research is needed to identify the cellular or viral target of these coumarins, as well as to make chemical modifications to these phenolic molecules that contribute to increased inhibition against RSV and reduce their toxic effects.