Papel das armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETs) no curso da infecção in vitro pelo vírus sincicial respiratório (RSV)

Abstract

Neutrófilos são recrutados para o tecido pulmonar de pacientes acometidos por diversas doenças respiratórias. No sítio de infecção, neutrófilos secretam NETs (Neutrophil Extracellular Traps) ,fibras de DNA decoradas com proteínas nucleares, granulares e citoplasmáticas. As NETs contribuem para a captura e inativação de diversos microorganismos. Um corpo crescente de evidências tem apresentado que o acúmulo das NETs resulta em efeitos citotóxicos diretos sobre células endoteliais e epiteliais. O hRSV (human Respiratory Syncytial Virus), é a causa mais comum de doença grave do trato respiratório inferior em crianças pequenas em todo o mundo, gerando um alto número de hospitalizações e um alto custo para o sistema de saúde. Neutrófilos estimulados pela proteína F do hRSV geram NETs capazes de capturar partículas virais e assim reduzir a disseminação viral. A massiva produção de NETs causa obstrução das vias aéreas e contribui para o agravamento da doença. O presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos benéficos e/ou deletérios das NETs no curso da infecção pelo hRSV. Para tanto, células Hep-2 foram infectadas in vitro com diferentes inóculos de hRSV, antes ou depois de terem sido incubadas com as NETs (0.5-16 µg/mL). Células apenas infectadas apresentaram redução na taxa metabólica, intensa coloração com azul de trypan, formação de numeros e volumosos sincícios. Comparativamente, o contato das células com as NETs, antes da infeçcão viral (MOI 0.1), resultou em melhora da taxa metabólica e da viabilidade celular, acompanhadas de redução no número e dimensão dos sincícios formados. O aumento do inóculo viral (MOIs 0.5 e 1) reduziu tais efeitos benéficos. Células já infectadas e, que foram pós-tratadas com as NETs, apresentaram sincícios mais volumosos, que numericamente estavam reduzidos. O aumento na concentração das NETs (≥ 8µg/mL) agravou a mortalidade celular, o que refletiu numa redução do número e da dimensão dos sincícios formados. Análises in silico, foram favoráveis à geração de complexos proteína F/MPO e proteína F/Catapsina-G, envolvendo sítios de neutralização viral. Em resumo, nas fases precoces da infecção, onde a concentração das NETs e a carga viral estão reduzidas, há um predominante efeito benéfico das NETs, que contribui na captura do virion e na proteção de células não infectadas. A intensa geração das NETs em fases mais tardias da infecção, causa agravamento da morte celular. O detalhamento dos mecanismos envolvidos no equilibrado papel das NETs, na imunopatologia das doenças respiratórias, fornece subsídios para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que modulem a geração e a função das NETs no tecido pulmonar.

Neutrophils are recruited into the lung tissue of patients suffering from various respiratory diseases. At the site of infection, neutrophils secrete NETs (Neutrophil Extracellular Traps), DNA fibers decorated with nuclear, granular and cytoplasmic proteins. NETs contribute to the capture and inactivation of various microorganisms. A growing body of evidence has shown that the accumulation of NETs results in direct cytotoxic effects on endothelial and epithelial cells. Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is the most common cause of severe lower respiratory tract disease in young children worldwide, leading to a high number of hospitalizations and a high cost to the health system. Neutrophils stimulated by hRSV F protein generate NETs capable of capturing viral particles and thus reduce viral spread. The massive production of NETs causes obstruction of the airways and contributes to the worsening of the disease. The present study aimed to evaluate the beneficial and/or deleterious effects of NETs in the course of hRSV infection. To this end, Hep-2 cells were in vitro infected with different hRSV load, either before or after incubation with the NETs (0.5-16 μg/mL). Infected cells had a reduction in the metabolic rate, intense staining with trypan blue, number formation and large syncytia. Cell contact with NETs prior to viral infection (MOI 0.1) resulted in improved metabolic rate and cell viability, accompanied by a reduction in the number and size of the syncytia. The increase of the viral inoculum (MOIs 0.5 and 1) reduced such beneficial effects. Already infected cells, which were post-treated with the NETs, presented larger syncytia, which were numerically reduced. The increase in NET concentration (≥ 8μg/mL) worsened cellular mortality, which reflected a reduction in the number and size of the syncytia. In silico analyzes, they favored the generation of F protein/MPO and F protein/Catapsin-G complexes, involving viral neutralization sites. In summary, in the early infection stages, where NETs concentration and viral load are low, there is a predominant beneficial effect of NETs, which contributes to virion capture and protection of uninfected cells. The intense generation of NETs in later infection stages causes worsening of cell death. Detailing the mechanisms involved in the balanced role of NETs in the immunopathology of respiratory diseases provides support for the development of therapeutic strategies that modulate the generation and function of NETs in lung tissue.