Uso de astaxantina em cultivo in vitro de embriões bovinos e efeitos na criopreservação

Abstract

O objetivo deste trabalho é avaliar se a adição de astaxantina (AST) ao meio de cultivo in vitro (CIV) pode exercer efeitos positivos em embriões bovinos após vitrificação. A AST é um carotenoide com altas propriedades antioxidantes, devido a uma estrutura molecular única contendo igações duplas conjugadas e grupos hidroxila (–OH) e ceto (C=O), que contribuem para eliminar EROs e bloquear a peroxidação lipídica (LPO). Os presumíveis zigotos foram atribuídos 22 horas após a fertilização in vitro em um dos seguintes tratamentos: G-CONT) Controle, G-DMSO) dimetilsulfóxido (1 μl de DMSO / 999 μl de meio CIV), G-AST 0,8) 0,8 nM de AST, G- AST 3) 3 nM de AST e G-AST 13) 13 nM de AST. Apenas blastocistos expandidos (BX) grau I no 7º dia de desenvolvimento foram vitrificados (n = 92, 95, 86, 99 e 95/grupo, respectivamente). Os embriões foram avaliados a fresco e vitrificados quanto à taxa de eclosão e reexpansão, viabilidade celular incluindo número total de células e apoptose pelo teste TUNEL, além dos níveis lipídicos de peroxidação dos meios de cultura com substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Nossos resultados mostraram que não houve diferença devido à suplementação de AST na formação de blastocistos no D7. Entretanto, a adição de 0,8, 3 e 13 nM de AST ao meio CIV aumentou a taxa de expansão dos blastocistos após 24 h nos grupos G-AST 0,8 (100A(100-100)); G-AST 3 (98A(100-100)); G-AST 13 (100A(100-100)) quando comparado ao G-CONT (93B(100-100)) e G-DMSO (94,3B(100-100)) e 48 h de cultura G-AST 0,8 (100A( 100-100)); G-AST 13 (100A(100-100)) quando comparado ao G-CONT (91,3B(83,3-100)); G-DMSO (92,4B(80-100)); G-AST 3 (95,5AB(100-100)), independente se o embrião era fresco ou vitrificado. A porcentagem de células apoptóticas nos embriões após vitrificação/aquecimento foi maior no G-AST 0,8 (17,9A(13,5-21,4)); (p<0,05) comparado ao G-DMSO 9,7B(8,1-10,7) e G-AST 3 (11,1B (10,0-12,8); (p<0,05). TBARS não mostrou efeito da astaxantina sob a LPO quando adicionada ao meio da CIV, não houve diferenças entre os grupos para os embriões do G-CONT no 7º dia de estágio de desenvolvimento (p > 0,05 ). Em conclusão, a suplementação com AST no meio de cultivo controlou parcialmente os efeitos da scrioinjúrias nos embriões vitrificados, levando à formação de blastocistos com uma taxa comparativamente aumentada de embriões BX após procedimentos de aquecimento. Tomados em conjunto, este estudo fornece novas perspectivas na compreensão de como a AST poderia melhorar a competência de desenvolvimento de embriões bovinos vitrificados.

ABSTRACT –The objective of this work is to evaluate whether the addition of astaxanthin (AST) to the in vitro culture medium (IVC) can exert positive effects on bovine embryos after vitrification. The AST is a carotenoid with high antioxidant properties, due a unique molecular structure containing conjugated double bonds, and hydroxyl (–OH) and keto (C=O) groups, which contribute to eliminate ROS and block lipid peroxidation (LPO). Presumable zygotes were assigned 22 hours after IVF in one of the following treatments: G-CONT) Control, G-DMSO) dimethyl sulfoxide (1 μl DMSO/999 μl IVC medium), G-AST 0.8) 0.8 nM of AST, G-AST 3) 3 nM of AST and G-AST 13) 13 nM of AST. Only grade I expanded blastocysts (XB) on 7th day of development were vitrified (n = 92, 95, 86, 99, and 95/group, respectively). Embryos were evaluated fresh and vitrified for hatching rate and re-expansion, also cell viability including the total number of cells and apoptosis by TUNEL test, in addition to peroxidation lipid levels of culture media with thiobarbituric acid reactive substances (TBARS). Our results showed that there was no difference due to AST supplementation in blastocyst formation on D7. However, the addition of 0.8, 3 and 13 nM of AST into the IVC medium increased the expansion rate of blastocysts after 24 h in the groups G-AST 0.8 (100A(100-100)); G-AST 3 (98A(100-100)); G-AST 13 (100A(100-100)) when compared to G-CONT (93B(100-100)) and G-DMSO (94.3B(100-100)) and 48 h of culture G-AST 0.8 (100A(100-100)); G-AST 13 (100A(100-100)) when compared to G-CONT (91.3B(83.3-100)); G-DMSO (92.4B(80-100)); G-AST 3 (95.5AB(100-100)), independent if the embryo was fresh or vitrified. The apoptotic cell percentage in the embryos after vitrification/warming was higher in the G-AST 0.8 (17.9A (13.5-21.4); (p<0.05) compared to G-DMSO 9.7B(8.1-10.7) and G-AST 3 (11.1B (10.0-12.8); (p<0.05). TBARS showed no effect of astaxanthin on IVC medium LPO, no differences among the groups to the embryos of the G-CONT at the 7th day of developmental stage (p > 0.05). In conclusion, supplementation with AST to the culture medium partially controlled cryoinjury effects on the vitrified embryos, leading to formation of blastocysts with a comparatively increased rate of XB embryos after warming procedures. Taken together, this study provides new perspectives in understanding how AST could improve the developmental competence of vitrified bovine embryos.