Construção e validação de biblioteca naÏve de VHH apresentado por fagos

Abstract

Anticorpos são proteínas essenciais na detecção de agentes estranhos, destacando-se pela alta especificidade e aplicabilidade em diagnóstico e terapias. Entre as suas variantes, os anticorpos de cadeia pesada (HCAbs), encontrados em camelídeos, como lhamas e alpacas, possuem como região de ligação ao antígeno o domínio variável VHH, com aproximadamente 15 kDa. Desde a aprovação do primeiro medicamento baseado em nanocorpos, o Caplacizumab, em 2019, o interesse pelo desenvolvimento dessas moléculas vem crescendo. Dentre as estratégias disponíveis, a construção e seleção de bibliotecas de naïve phage display tem se destacado pela possibilidade de rápida seleção de anticorpos, aproveitando o repertório imunológico natural dos animais. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo inicial de implementar e padronizar a construção de uma biblioteca naïve de VHHs exibidos em fagos, visando futuramente a geração de novas bibliotecas imunes contra alvos farmacêuticos de interesse. Para isso, foram coletadas amostras de sangue de quatro lhamas não imunizadas mantidas em fazendas, seguidas da separação de células mononucleares do sangue periférico por gradiente de centrifugação. O RNA total foi extraído e convertido em cDNA, e os genes de VHH amplificados por Nested PCR. Os fragmentos obtidos foram clonados no vetor pCOMB3XSS por digestão com SfiI e ligação com T4 DNA ligase. Vinte e uma alíquotas de E. coli eletrocompetentes foram transformadas via eletroporação, resultando em 6,39.10⁷ transformantes. A avaliação por PCR de colônia e sequenciamento por Sanger revelou uma taxa de inserção correta de 26%. As análises demonstraram uma variabilidade clonal de 100%, resultando em um tamanho estimado real de 1,66.10⁷ clones funcionais. Apesar das tentativas de otimizar as etapas de clonagem, a nova biblioteca obtida resultou em 2,82.106 transformantes. Assim, alternativas para otimizar o processo de clonagem estão sendo estudadas para os próximos passos. Ainda, esse projeto contribui para o fortalecimento da capacidade nacional na construção de bibliotecas de nanocorpos, e abre caminhos para a construção de bibliotecas imunes direcionadas a alvos de interesse farmacêutico com potencial aplicação em biotecnologia e saúde.