Caracterização do gene snDNA U4 em peixes da ordem Characiformes (Vertebrata: Teleostei)

Abstract

A enorme diversidade da biosfera terrestre se deve, em grande parte, à evolução do splicing, mecanismo molecular presente em todos os eucariotos que é responsável pela retirada dos íntrons para a produção do RNAm maduro. No centro da maquinaria molecular responsável por este processo, estão os pequenos RNAs nucleares (snRNAs), transcritos pelos genes Us, como os snDNAs U1, U2, U4, U5 e U6, que estão organizados em tandem nos genomas de eucariotos, onde cópias gênicas e espaçadoras são repetidas dezenas de vezes de maneira enfileirada. Até meados da década passada, a caracterização da organização de genes arranjados desta forma era bastante laboriosa, exigindo uma rotina de tecnologia do DNA recombinante para clonar e sequenciar unidades parciais destas sequências. Com o progresso e popularização de técnicas de sequenciamento massivo, em conjunto com o desenvolvimento de ferramentas bioinformáticas adequadas, a caracterização deste tipo de sequência em espécies não-modelo se tornou viável. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi caracterizar as unidades repetidas em tandem do snDNA U4 em diferentes espécies de peixes Characiformes a partir de uma pipeline semiautomatizada, utilizando reads curtos brutos (2x100nt). A aplicação deste método permitiu a caracterização completa do snDNA U4 (região codificadora + espaçadora) para todas as espécies escolhidas. Os resultados revelaram que a região codificadora é bastante conservada entre espécies, enquanto a região espaçadora é muito variável, tanto em tamanho (de 664nt a 1464nt) quanto em composição. Do ponto de vista de variação intragenômica, é possível notar que mais de 90% dos polimorfismos estão localizados nas regiões espaçadoras, conforme era esperado pela teoria, uma vez que alterações nas regiões de transcrição geralmente são eliminadas pelo processo de seleção purificadora. Os resultados obtidos aqui indicam que pipelines apropriadas são excelentes alternativas à métodos de biologia molecular clássica, como clonagem e sequenciamento de Sanger.

The vast diversity of the terrestrial biosphere is largely attributed to the evolution of splicing, a molecular mechanism present in all eukaryotes responsible for removing introns to produce mature mRNA. At the core of the molecular machinery governing this process are small nuclear RNAs (snRNAs), transcribed by U genes, such as U1, U2, U4, U5, and U6, organized in tandem in eukaryotic genomes, where gene copies and spacers are repeated dozens of times in a linear arrangement. Until the mid-2000s, characterizing the organization of genes arranged in this manner was laborious, requiring a routine of recombinant DNA technology to clone and sequence partial units of these sequences. With the progress and popularization of massive sequencing techniques, coupled with the development of suitable bioinformatic tools, characterizing this type of sequence in non-model species has become feasible. In this regard, the objective of this study was to characterize the tandemly repeated units of U4 snDNA in different Characiformes fish species using a semi-automated pipeline, utilizing raw short reads (2x100nt). The application of this method allowed for the complete characterization of the U4 snDNA (coding region + spacer) for all chosen species. Results revealed that the coding region is highly conserved across species, while the spacer region is highly variable, both in size (ranging from 664nt to 1464nt) and composition. From an intragenomic variation perspective, it is notable that over 90% of polymorphisms are located in the spacer regions, as expected by theory, since alterations in transcription regions are typically eliminated by purifying selection. The obtained results indicate that appropriate pipelines are excellent alternatives to classical molecular biology methods, such as cloning and Sanger sequencing.