Caracterização biológica de um clone infeccioso do Citrus tristeza virus (CTV) de origem brasileira, utilização do vetor viral CTV para o controle de Candidatus Liberibacter asiaticus e método multiplex de detecção das bactérias associadas ao Huanglongbing

Abstract

A citricultura tem notável importância econômica para o Brasil, sendo responsável por 76% do comércio mundial de suco de laranja. Porém, tem enfrentado situações adversas como a sucessão de doenças, sendo atualmente a mais devastadora o Huanglongbing (HLB), causada pelas bactérias Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) e Candiudatus Liberibacter americanus (Lam) e transmitidas pelo inseto vetor Diaphorina citri. Pela ausência de cultivares cítricos comerciais com caráter resistentes ao HLB, faz-se necessário a busca de resistência por meio de melhoramento genético convencional ou através da biotecnologia. Este trabalho teve como objetivo empregar o vetor viral Citrus tristeza virus (CTV) para expressar genes com ação antimicrobiana, destacando a vantagem de o vírus colonizar as células do floema, mesmo local de colonização das liberibactérias. Além disso, neste trabalho foi realizado o sequenciamento e avaliação biológica do primeiro clone infeccioso CTV de origem brasileira (PIAC-VT). Os resultados obtidos confirmaram que a construção do clone PIAC-VT foi alcançada com sucesso tanto in vitro quanto in vivo, com um genoma de 19252 pb. O vírus PIAC-VT manteve suas características biológicas como replicação, movimento e indução de sintomas após os processos de sua clonagem, possibilitando cumprir os postulados de Koch. As plantas de citros contendo os vírus CTV expressando os antimicrobianos foram desafiadas com a inoculação de Las e foram avaliadas por qPCR multiplex por um período de 238 dias. Não houve, entretanto, controle de Las com os genes de interesse utilizados. O método de qPCR empregado para detecção e quantificação bacteriana desenvolvido neste trabalho demonstrou ser seguro, sensível e específico para detectar Las, Lam e fitoplasma do grupo 16SrIX numa única reação, podendo ser empregado para citros e psilídeos. Embora, os peptídeos antimicrobianos expressos via vetor CTV não mostraram efeito bactericida ou bacteriostático contra Las, a manipulação bem-sucedida do vetor viral CTV é uma conquista significativa, pois possibilitou a incorporação da tecnologia de uso do vetor CTV no Brasil. Com base nos resultados, podemos afirmar que o clone infeccioso PIAC-VT é funcional e pode ser uma nova ferramenta de estudos de genética reversa a ser aplicada aos citros, podendo ser aplicado na busca de uma citricultura mais sustentável e produtiva.

ABSTRACT Citriculture is one of the most economically important crops for Brazil, accounting for 76% of the world's orange juice market. However, it has faced adverse situations, including a succession of diseases, with Huanglongbing (HLB) being the most devastating one. HLB is caused by the bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) and Candidatus L. americanus (Lam) and transmitted by the vector insect Diaphorina citri. Due to the lack of commercial citrus cultivars resistant to HLB, the search for resistance becomes necessary through conventional genetic breeding or biotechnology. This study aimed to use the viral vector Citrus tristeza virus (CTV) to express genes with antimicrobial action, highlighting the advantage of the virus colonize phloem cells, the same site that liberibacteria colonize. Furthermore, in this work, the sequencing and biological assessment of the first Brazilian origin infectious CTV clone (PIAC-VT) was performed. The results obtained confirmed that the PIAC-VT clone construction was successfully achieved, both in vitro and in vivo, with a genome size of 19252 bp. The PIAC-VT virus retained its biological characteristics such as replication, movement, and symptom induction after the cloning processes, fulfilling Koch's postulates. Citrus plants containing CTV viruses expressing antimicrobials were challenged with Las inoculation and assessed by multiplex qPCR over a period of 238 days. However, there was no Las control using the target genes. The qPCR method employed for bacteria detection and quantification in this study proved to be safe, sensitive, and specific for detecting Las, Lam, and 16SrIX group phytoplasma in a single reaction, applicable to both citrus and psyllids. Although the antimicrobial peptides expressed via CTV vector did not exhibit a bactericidal or bacteriostatic effect against Las, the CTV viral vector successful manipulation represents a significant achievement, enabling the incorporation of CTV vector technology in Brazil. Based on the results, it could be affirmed that PIAC-VT infectious clone is functional and may serve as a new tool for reverse genetics studies applied to citrus, contributing to the search of a more sustainable and productive citriculture.